劉 盼，鄭海濤，何計(jì)國(guó)

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

格列本脲人工抗原的合成與鑒定

劉 盼，鄭海濤，何計(jì)國(guó)*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

目的：合成格列本脲人工抗原。方法：采用對(duì)氨基苯甲酸法制備半抗原，將半抗原分別與牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)通過(guò)碳二亞胺法偶聯(lián)制備免疫原(Gli-BSA)和包被原(Gli-OVA)，利用紫外掃描進(jìn)行抗原的化學(xué)鑒定，通過(guò)免疫原免疫Balb/c小鼠，間接酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定抗血清進(jìn)行生物鑒定。結(jié)果：制備了Gli-BSA、Gli-OVA的人工抗原，經(jīng)紫外光譜掃描，偶聯(lián)比分別為4:1和17.7:1。免疫小鼠后獲得抗血清的效價(jià)均達(dá)到32000以上，半抑制質(zhì)量濃度為10μg/mL。結(jié)論：成功合成了格列本脲人工抗原，并獲得了格列本脲抗體，為格列本脲的免疫學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)一步研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

格列本脲；半抗原；載體蛋白；完全抗原

格列本脲，又名優(yōu)降糖，作為第二代的磺酰脲類(lèi)降糖西藥被廣泛用于糖尿病的治療?；酋ｋ孱?lèi)藥物具有刺激β細(xì)胞分泌胰島素、減輕胰島素抵抗，降低空腹和餐后血糖的作用，是目前治療非胰島素依賴(lài)型糖尿病最主要的口服降糖藥[1]。主要不良反應(yīng)有過(guò)敏反應(yīng)，胃腸反應(yīng)和低血糖反應(yīng)，年老體弱和肝腎功能不全者易發(fā)生低血糖反應(yīng)造成昏迷與死亡。死亡率可達(dá)11%，不可逆腦損傷可達(dá)5%[2-3]。作為一種處方藥，使用時(shí)有其嚴(yán)格的劑量與時(shí)間要求，而由于格列本脲較好的降糖效果和低廉的價(jià)格，常被商家非法添加到保健食品和中成藥中，對(duì)消費(fèi)者的身體健康產(chǎn)生不良影響，因此有必要開(kāi)發(fā)一種快速有效的檢測(cè)方法。現(xiàn)有檢測(cè)方法主要為：薄層色譜法[4-5]、液相色譜法[6-7]、液質(zhì)聯(lián)用法[8-9]

等。薄層色譜法只能進(jìn)行定性檢測(cè)，且假陽(yáng)性率高，其他方法則前處理復(fù)雜、煩瑣耗時(shí)、儀器價(jià)格昂貴，且不適宜于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。近年來(lái)，免疫分析技術(shù)已經(jīng)越來(lái)越廣泛的應(yīng)用于農(nóng)獸藥殘留分析和摻偽食品鑒定領(lǐng)域，以其簡(jiǎn)單、廉價(jià)、快捷、靈敏度高、適用于大批量樣品檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)而成為一種重要的分析方法。目前尚未見(jiàn)格列本脲的免疫化學(xué)檢驗(yàn)方法及產(chǎn)品的報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了格列本脲免疫原的和包被原合成，為格列本脲單克隆抗體的制備和檢驗(yàn)試劑的研發(fā)提供研究試材。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

格列本脲(99%) Afla(天津)有限公司。

6周齡雌性Balb/c小鼠8只，20g/只，SPF級(jí)，購(gòu)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

對(duì)氨基苯甲酸 天津市精細(xì)化工研究所；N- 羥基琥珀酰亞胺(NHS) 德國(guó)Merck-Schuehardt公司；對(duì)乙基-N,N-二甲基丙基碳二亞胺(EDC)(化學(xué)純) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、乙二胺(EDA)、硼酸、鹽酸、亞硝酸鈉(化學(xué)純) 北京化學(xué)試劑公司；牛血清白蛋白(BSA)第五組分(含量＞98.0%)、卵清白蛋白(OVA)、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑 美國(guó)Sigma公司；薄層色譜硅膠預(yù)制板 煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所；Tween-20(純度＞98.0%) 美國(guó)Fluka公司；0.01mol/L pH7.4的PBS溶液(磷酸緩沖液)、考馬斯亮藍(lán)染液、包被緩沖液(0.05mol/L pH9.6 的碳酸鹽緩沖液)、封閉液(含1%明膠的0.05mol/L pH9.6 的碳酸鹽緩沖液)、洗滌液PBST(含0.05% Tween-20的0.01mol/L，pH7.4的PBS)、底物緩沖液(pH5.0的磷酸-檸檬酸緩沖液)、底物TMB(2mg/mL DMSO)、終止液(2mol/L H2SO4)均為實(shí)驗(yàn)室配制。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1004 電子分析天平 北京東南儀誠(chéng)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；722S 分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；UV-2450 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津分析儀器公司；Alpha-Pure 純水系統(tǒng) 上海瑞楓生物科技有限公司；LGJ-10冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠(chǎng)；JB21磁力攪拌器 上海雷磁新涇儀器；ROTINA35 臺(tái)式離心機(jī) 德國(guó)Hettich公司；透析袋(分子質(zhì)量12000～14000D)北京拜爾迪有限公司。

1.3 抗原合成

1.3.1 半抗原的合成

1.3.1.1 格列本脲的脫甲基化[10]

試劑與條件：BBr3，CH2Cl2，溫度0℃后逐漸至室溫，時(shí)間為2d，按圖1的合成路線(xiàn)委托其他實(shí)驗(yàn)室合成。

圖1 格列本脲衍生物的合成路線(xiàn)Fig.1 Synthetic route of glibenclamide derivatives

1.3.1.2 半抗原的合成[11]

稱(chēng)取20mg(145μmol)對(duì)氨基苯甲酸(Mr＝137)溶于2.2mL 0.2mol/L的HCl，0～4℃攪拌，得到A液。將12mg (174μmol)NaNO2溶于0.35mL蒸餾水，得到B液。將B液逐滴加入A液中，避光攪拌反應(yīng)1h，得到C液，溶液略帶微黃色。稱(chēng)取30.1mg(62.7μmol)格列本脲衍生物，溶于600μL DMF，再加入10mL 4℃的0.05mol/L硼砂緩沖液(pH8.5，含0.15mol/L NaCl)，0～4℃攪拌、反應(yīng)，得到D液。將1.5mL C液加入到D液中，避光反應(yīng)2h。加H3BO3晶體調(diào)節(jié)pH值至7.4，得到半抗原。

通過(guò)薄層層析法和質(zhì)譜法進(jìn)行半抗原合成的鑒定。合成路線(xiàn)見(jiàn)圖2。

圖2 格列本脲半抗原的合成路線(xiàn)Fig.2 Synthetic route of glibenclamide hapten

1.3.2 完全抗原的合成

免疫原(Gli-BSA)的合成采用牛血清白蛋白(BSA)為載體。先活化BSA蛋白得到cBSA。

cBSA的制備[10]：將18mg(300μmol) EDA慢慢滴入4℃的20mL(0.01mol/L pH7.4)磷酸鹽緩沖液PBS中，0～4℃攪拌，向該溶液中逐滴加入濃鹽酸，調(diào)pH值至7.4；稱(chēng)取1g BSA(15 μ mol)和56mg (300 μ mol)EDC加入上述EDA的溶液中，室溫反應(yīng)2h。反應(yīng)完畢后，反應(yīng)液用玻砂漏斗抽濾，取上清液透析以除去多余的EDA。用PBS (0.01mol/L pH7.4)緩沖液0～4℃透析5d，每8h更換一次透析液。將透析后的溶液凍干，得白色絮狀固體，-20℃保存。

免疫原的合成[12]：加入136mg(2μmol)的cBSA，隨后加入120mg(626μmol)EDC，36mg(313μmol)的NHS，室溫?cái)嚢? h。得到酒紅色反應(yīng)液(合成的目標(biāo)產(chǎn)物Mr=628.1)。用PBS(0.01mol/L，pH7.4)0～4℃透析3d，每8h更換一次透析液。

另以卵清蛋白(OVA)為載體蛋白，同法合成包被原(Gli-OVA)。

通過(guò)考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定合成抗原的蛋白濃度，紫外(200～400nm)掃描測(cè)定偶聯(lián)比。

偶聯(lián)比的計(jì)算方法[13]：

式中：A330nm為抗原在小分子最大吸收波長(zhǎng)處(330nm)的吸光度；為BSA在其最大吸收波長(zhǎng)處(278nm)的吸光度；為BSA在小分子最大吸收波長(zhǎng)處(330nm)的吸光度；為小分子在其最大吸收波長(zhǎng)處(330nm)的吸光度；為小分子在BSA最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度；A278nm為偶聯(lián)物在BSA最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度；C1為小分子標(biāo)準(zhǔn)物濃度(mol/L)；C2為BSA標(biāo)準(zhǔn)物濃度(mol/L)。

Gli-OVA偶聯(lián)物鑒定方法同上。

1.4 動(dòng)物免疫

選取8只6周齡的Balb/c雌性小鼠，兩只用作陰性對(duì)照，另外6只用免疫原BSA-Gli進(jìn)行免疫。免疫劑量為100μg/只，首次免疫采用等量弗氏完全佐劑乳化后皮下多點(diǎn)注射，以后每?jī)芍苊庖咭淮?，采用等量弗氏不完全佐劑乳化后注射。?次免疫后7d對(duì)小鼠進(jìn)行眼眶采血約0.1mL/只，室溫靜置1h，再置4℃冰箱過(guò)夜，4000r/min離心10min，收集血清，-20℃保存。采用間接ELISA方法[14]，用Gli-OVA作為包被原測(cè)定免疫小鼠的抗血清。

2 結(jié)果與分析

2.1 半抗原的合成

通過(guò)重氮化反應(yīng)，將對(duì)氨基苯甲酸以氮氮雙鍵連接于格列本脲的苯環(huán)上，采用薄層層析法和質(zhì)譜法進(jìn)行產(chǎn)物鑒定。

2.1.1 薄層色譜鑒定

薄層色譜法[15](展開(kāi)劑：氯仿、環(huán)己烷、乙醇、冰醋酸體積比8:13:1:1)，結(jié)果顯示，在硅膠板上Rf為0.74處出現(xiàn)新的展開(kāi)點(diǎn)(脫甲基格列本脲的Rf為0.86、對(duì)氨基苯甲酸的Rf為0.57)，表明反應(yīng)產(chǎn)生了不同于格列本脲衍生物和對(duì)氨基苯甲酸的物質(zhì)，說(shuō)明發(fā)生了重氮化反應(yīng)并產(chǎn)生了新物質(zhì)。

2.1.2 質(zhì)譜鑒定

圖3 格列本脲半抗原的質(zhì)譜鑒定圖Fig.3 Mass spectrum of glibenclamide hapten

由圖3可見(jiàn)，反應(yīng)物中存在m/z為650.1的質(zhì)譜峰，由于本次質(zhì)譜為加鈉的分子離子峰[M+Na-H]，因此650.1的質(zhì)譜峰表明生成了相對(duì)分子質(zhì)量為628.10(650.1-23+1)的產(chǎn)物，該產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量與目標(biāo)產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量628.15一致，結(jié)合反應(yīng)路線(xiàn)，可以推斷合成產(chǎn)物即為所需的目標(biāo)半抗原，說(shuō)明該合成路線(xiàn)可以用于格列本脲半抗原的合成。同時(shí)可見(jiàn)，650.1的分子離子峰是最強(qiáng)峰，表明新產(chǎn)物為反應(yīng)體系中的主要物質(zhì)，說(shuō)明反應(yīng)產(chǎn)物具備相對(duì)較高的純度。

2.2 完全抗原的制備

通過(guò)碳二亞胺法將半抗原的羧基與載體蛋白的氨基偶聯(lián)，分別制備免疫原和包被原，產(chǎn)物采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，采用紫外掃描鑒定偶聯(lián)比。

2.2.1 完全抗原的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度

用考馬斯亮藍(lán)G-250法[16]測(cè)定完全抗原的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，以吸光度的相對(duì)百分?jǐn)?shù)(%)為縱坐標(biāo)做工作曲線(xiàn)，分別得到BSA的工作曲線(xiàn)方程為y=0.7295χ+0.0229，R2=0.9999；OVA的工作曲線(xiàn)方程為y=0.52χ-0.01，R2=0.9984。根據(jù)BSA、OVA的工作曲線(xiàn)計(jì)算Gli-BSA、Gli-OVA的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度分別為8.1、4.6mg/mL。

2.2.2 完全抗原的鑒定及偶聯(lián)比

用紫外掃描檢測(cè)法測(cè)定兩種不同方法合成的人工抗原中半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)情況。根據(jù)偶聯(lián)物中所測(cè)蛋白的質(zhì)量濃度，將載體蛋白及偶聯(lián)物均配制成0.2mg/mL，格列本脲衍生物配成0.02mg/mL，并將上述溶液在200～400nm掃描其紫外吸收，根據(jù)掃描圖譜進(jìn)行偶聯(lián)產(chǎn)物的鑒定。

圖4 免疫原Gli-BSA的紫外掃描圖譜Fig.4 UV scanning spectrum of immunogen Gli-BSA

圖5 包被原Gli-OVA的紫外掃描圖譜Fig.5 UV scanning spectrum of coating antigen Gli-OVA

由圖4、5可見(jiàn)，偶聯(lián)物Gli-BSA/Gli-OVA與BSA/OVA在相同的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度下，吸收曲線(xiàn)發(fā)生了改變，在Gli-OH的最大吸收范圍內(nèi)，吸光度增加，表明偶聯(lián)物的紫外吸收峰為蛋白質(zhì)和半抗原吸收峰的疊加，說(shuō)明載體蛋白成功偶聯(lián)上了一定數(shù)目的小分子半抗原，生成了完全抗原，與BSA偶聯(lián)的可以作為免疫原，與OVA偶聯(lián)的可以作為包被原。

根據(jù)圖譜計(jì)算結(jié)果為免疫原Gli-BSA和包被原Gli-OVA的偶聯(lián)比分別是：4:1和17.7:1。

2.3 免疫效果的測(cè)定結(jié)果

用Gli-OVA作為包被原，用間接ELISA法測(cè)定免疫原Gli-BSA免疫小鼠3次后獲得的小鼠抗血清，效價(jià)均達(dá)到32000以上，半抑制質(zhì)量濃度(IC50)為10μg/mL，說(shuō)明合成的免疫原能夠刺激小鼠產(chǎn)生抗體，該抗體和格列本脲小分子具有一定的親和力，格列本脲小分子可以和包被原競(jìng)爭(zhēng)該抗體，能夠制備間接競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定格列本脲的測(cè)試試劑盒，并可以通過(guò)細(xì)胞融合制備單克隆抗體。

3 討 論

格列本脲相對(duì)分子質(zhì)量為494.01(＜1000)， 為小分子物質(zhì)，只有反應(yīng)原性而無(wú)免疫原性，不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體和致敏淋巴細(xì)胞，因而需要與大分子的載體蛋白偶聯(lián)，合成既有反應(yīng)原性又有免疫原性的人工全抗原[17]。

抗原合成有多種方法，都是要通過(guò)半抗原小分子上一定的官能團(tuán)(如—COOH或—NH2)連接到載體蛋白上，沒(méi)有特征官能團(tuán)的小分子則需先經(jīng)過(guò)衍生等分子修飾使其帶上可連接載體的官能團(tuán)。因?yàn)楦窳斜倦宓姆肿咏Y(jié)構(gòu)沒(méi)有可以偶聯(lián)載體蛋白的活性基團(tuán)，本實(shí)驗(yàn)選擇通過(guò)去甲基，使苯環(huán)上的甲氧基變成酚羥基，再通過(guò)酚羥基的鄰位反應(yīng)，用對(duì)氨基苯甲酸的重氮鹽取代酚羥基鄰位的氫，從而給格列本脲分子接上一個(gè)對(duì)氨基苯甲酸作為間隔臂，同時(shí)也提供了可接蛋白的活性基團(tuán)—COOH。這個(gè)結(jié)構(gòu)完整的保留了格列本脲分子中可能的抗原決定簇部分磺酰脲基團(tuán)和苯環(huán)上的雜原子氯?；酋ｋ褰Y(jié)構(gòu)是磺酰脲類(lèi)降糖藥的共性結(jié)構(gòu)，如果產(chǎn)生了針對(duì)此部分的抗體，則可建立檢測(cè)整個(gè)磺酰脲類(lèi)的ELISA檢測(cè)方法，具有重要意義。

采用了碳二亞胺法將半抗原與載體蛋白相偶聯(lián)合成抗原，碳二亞胺作為一種脫水劑，可使小分子和蛋白載體間經(jīng)過(guò)羥氨縮合反應(yīng)連接，格列本脲半抗原的—COOH和載體蛋白分子的—NH2在碳二亞胺的脫水作用下連接。

免疫原的特異性不僅與偶聯(lián)物的分子及結(jié)構(gòu)性質(zhì)相關(guān)，還與每個(gè)蛋白分子上偶聯(lián)的小分子的數(shù)目相關(guān)，因此在免疫前，測(cè)定人工抗原中載體上連接的小分子數(shù)目是非常重要的。通常每一載體上含有8～25個(gè)半抗原能得到效價(jià)較高的抗體[18]，也有研究認(rèn)為，偶聯(lián)比為3:1～45:1時(shí)，免疫原性較強(qiáng)[19]。本研究用紫外吸收光度法測(cè)得免疫原和包被原偶聯(lián)比分別為4:1和17.7:1，在3:1～45:1的范圍內(nèi)，免疫小鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，三免后效價(jià)均達(dá)到32000以上，半抑制濃度達(dá)到10μg/mL，也間接說(shuō)明了抗原合成成功，與趙肅清等[19]的報(bào)道一致。

4 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)氨基苯甲酸法合成了格列本脲半抗原，碳二亞胺法成功合成了格列本脲免疫原和包被原，偶聯(lián)比分別為4:1和17.7:1，免疫小鼠效價(jià)均達(dá)32000以上，半抑制質(zhì)量濃度達(dá)到10μg/mL，可以用于下一步單克隆抗體的制備及免疫學(xué)快速檢測(cè)方法的建立。

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Synthesis and Identification of Artificial Antigen for Glibenclamide

LIU Pan，ZHENG Hai-tao，HE Ji-guo*
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

Objective: To synthesize artificial antigen for glibenclamide. Methods: Hapten was synthesized by diazo reaction with p-aminobenzoic acid, and conjugated separately with BSA (bovine serum albumin) and OVA (ovalbumin) by carbodiimide method. Immunogen and coating antigen were obtained and designated as Gli-BSA and Gli-OVA, respectively. The synthesized artificial antigens were identified by mass spectrometry and UV spectroscopy. The immunogen was used to immunize Balb/c mice and the generated anti-serum was analyzed by indirect ELISA. Results: Gli-BSA and Gli-OVA were successfully synthesized with a coupling ratio of 4:1 and 17.7:1, respectively. The anti-serum titers after the first, second and third immunization of Balb/c mice were all above 32000 and the IC50 was 10 μg/mL. Conclusion: Artificial antigens for glibenclamide has been successfully synthesized and anti-glibenclamide antibodies have been acquired. This study can provide a basis for further studies on immunological detection of glibenclamide.

glibenclamide；hapten；carrier protein；complete antigen

TS201.2

A

1002-6630(2012)01-0200-04

2011-03-22

劉盼(1986—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)與食品安全。E-mail：pingdiguo2137@yahoo.com.cn

*通信作者：何計(jì)國(guó)(1966—)，男，副教授，研究方向?yàn)楣δ苁称芬约笆称钒踩珯z測(cè)。E-mail：hejiguo0870@sina.com