姚東瑞，盤賽昆，周鳴謙，王淑軍，胡金玲

(淮海工學(xué)院食品工程學(xué)院，江蘇 連云港 222005)

菠蘿蛋白酶水解泥鰍蛋白制備ACE抑制肽的研究

姚東瑞，盤賽昆，周鳴謙，王淑軍，胡金玲

(淮海工學(xué)院食品工程學(xué)院，江蘇 連云港 222005)

為了探討利用泥鰍蛋白制備功能性肽的可能性，采用高效液相色譜法測(cè)定泥鰍肉水解物對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)的抑制作用，從胰蛋白酶、胃蛋白酶、菠蘿蛋白酶、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶5種酶中篩選出菠蘿蛋白酶作為酶解泥鰍肉制備具有降血壓活性水解物的適宜水解酶。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)該酶的酶解條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明最佳水解條件為：溫度55℃，固液比1:3，pH6.5，加酶量1000U/g pro，水解時(shí)間90min。在該條件下，水解物的ACE抑制率IC50值為0.0184mg/mL，ACE抑制肽的相對(duì)分子質(zhì)量主要集中在924左右。

泥鰍；酶解；降血壓；血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)；菠蘿蛋白酶

高血壓是對(duì)人類健康危害極大的一種疾病，在西方國家1/4的人群受其影響[1]，全世界每年因高血壓死亡的人數(shù)高達(dá)1200萬[2]。據(jù)國家高血壓研究中心最新統(tǒng)計(jì)，我國高血壓患者己達(dá)1.2億人，發(fā)病率為10.8%，其危害僅次于腫瘤[3]。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin-I converting enzyme，ACE，EC 3. 4.15.1)是一種含鋅的二肽羧基肽酶[3]，是動(dòng)物體內(nèi)血壓控制的一種關(guān)鍵物質(zhì)[4]。ACE催化血管緊張素-Ⅰ脫去C未端兩個(gè)氨基酸殘基形成活性很強(qiáng)的血管緊張素-Ⅱ，而血管緊張素-Ⅱ是腎素——血管緊張素調(diào)節(jié)系統(tǒng)中已知活性最強(qiáng)的血管收縮劑，它能作用于小動(dòng)脈，使血管平滑肌收縮，迅速引起升壓效應(yīng)；同時(shí)還能刺激醛固酮分泌和直接對(duì)腸胃作用(減少腎血流量及促進(jìn)Na+、K+的重吸收)，引起鈉貯量和血容量的增加，也能使血壓升高。緩激肽是降血壓物質(zhì)，ACE也能作用于緩激肽，催化從其C未端脫去兩個(gè)氨基酸殘基而使其失活，從而也使血壓升高[4]。因此，如果抑制了ACE的活性，就能有效防止和治療高血壓的發(fā)生。降血壓肽能夠競(jìng)爭(zhēng)性地與ACE結(jié)合，從而抑制其發(fā)揮作用。自Ferreira等從蛇毒中首次發(fā)現(xiàn)天然ACE抑制肽以來，食源性降血壓肽具有無毒副作用、安全性高的特點(diǎn)而倍受科研工作者的關(guān)注[5-8]。

泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)系鰍科動(dòng)物，肉或全體可入藥，收載于《中藥大辭典》[9]。中醫(yī)認(rèn)為，泥鰍性味甘、平、無毒，具有調(diào)中益氣、壯陽祛濕等功能，可用于治療肝炎、皮膚瘙癢、水腫、黃疸和痔瘡等疾病[10-11]。泥鰍是滋補(bǔ)佳品，素有“水中人參”之美譽(yù)，肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美，分析表明，泥鰍蛋白質(zhì)含量達(dá)17%左右，谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸與甘氨酸4種鮮味氨基酸的含量遠(yuǎn)超過其他魚類[12]，是一種高蛋白、低脂肪的高檔營養(yǎng)珍品[13]。泥鰍是一種食性雜、生產(chǎn)潛力大、很有發(fā)展前途的養(yǎng)殖品種，國內(nèi)外市場(chǎng)的需求量較大[13]。我國除青藏高原外，各地的河川、溝渠、水田、池塘都有泥鰍的分布，僅連云港地區(qū)養(yǎng)殖水面就達(dá)16000多畝，是一種優(yōu)質(zhì)而豐富的蛋白質(zhì)資源。近年來，如何高效利用泥鰍蛋白成為研究的焦點(diǎn)。利用蛋白酶專一水解特性，將蛋白質(zhì)中無活性的氨基酸序列釋放為具有各種活性的肽段是一種食源性功能肽的有效制備方法[14]。You Lijun等[10]利用木瓜蛋白酶和復(fù)合蛋白酶水解泥鰍蛋白制備抗氧化活性肽，而酶解泥鰍蛋白制備降血壓肽的研究尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)利用高效液相色譜法測(cè)定泥鰍蛋白水解物對(duì)ACE的抑制活性，以水解度(DH)和水解產(chǎn)物對(duì)ACE的抑制率為指標(biāo)對(duì)酶解過程進(jìn)行分析，旨在為利用泥鰍蛋白制備降壓肽提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活泥鰍購于連云港敦尚鎮(zhèn)泥鰍養(yǎng)殖基地，經(jīng)淮海工學(xué)院水產(chǎn)養(yǎng)殖系程漢良教授鑒定為泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)，去頭、尾和血并洗凈，置于-40℃冰箱中冷凍備用。

復(fù)合蛋白酶(42300U/g)、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶(31800U/g) 諾維信(沈陽)生物加工有限公司；菠蘿蛋白酶(14000U/g)、胰蛋白酶(15000U/g)、胃蛋白酶(35000U/g) 廣州市齊云生物技術(shù)有限公司；ACE(從兔肺提取)、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(HHL)、卡托普利 美國Sigma公司；乙腈、三氟乙酸(色譜純) 美國Fisher公司。

1.2 儀器與設(shè)備

日立CR22G高速冷凍離心機(jī) 日本Hitach公司；BioLogic DuoFlowTM層析系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；PHS-3C型pH計(jì) 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Waters600高效液相色譜儀 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 泥鰍蛋白酶解工藝流程

鮮活泥鰍→預(yù)處理(去頭、去內(nèi)臟、用自來水洗凈、瀝干)→冷凍備用→解凍→加蒸餾水勻漿→調(diào)整酶解條件→酶解→滅酶(沸水浴，10min)→冷卻→調(diào)pH8.3→離心(10000r/min，30min)→取上清液→-18℃保存或凍干備用

1.3.2 蛋白酶活力測(cè)定

采用Folin-酚法，以酪蛋白為底物，參照GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》[15]附錄1方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 泥鰍蛋白水解度測(cè)定

式中：CN為水解液中游離氨基氮的含量/(g/100mL)；CNO為魚糜勻漿水解前游離氨基氮的含量/(g/100mL)；C為魚糜勻漿中總蛋白氮的含量/(g/100mL)。

蛋白質(zhì)及蛋白氮含量采用凱氏定氮法測(cè)定，參照GB5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》[16]的方法進(jìn)行，游離氨基氮含量采用甲醛電位滴定法測(cè)定[17]。

1.3.4 水解物ACE 抑制活性的RP-HPLC測(cè)定

參照文獻(xiàn)[18-20]的方法，并略有改進(jìn)。ACE、HHL分別用0.1mol/L硼酸鈉緩沖液(含0.3mol/L NaCl，pH8.3)配成25mU/mL ACE溶液和8.3mmol/L HHL溶液；馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)品用超純水配成5mg/mL的貯存液，使用時(shí)稀釋成不同濃度的使用液。取25μL樣品溶液和75μL HHL溶液混勻，于37℃保溫10min，加入50μL ACE溶液，在37℃反應(yīng)60min后，加入150μL濃度為1mol/L HCl溶液終止反應(yīng)，10000r/min離心15min，取上清液進(jìn)行分析，同時(shí)用硼酸鈉緩沖液代替樣品溶液做空白對(duì)照。

色譜條件：SunfireTMC18柱(4.6mm×150mm，50μm)；洗脫液為15%乙腈+85%水(含0.05%三氟乙酸)；流速為1.0mL/min；檢測(cè)波長為228nm；進(jìn)樣量為20μL；柱溫為30℃。按式(2)計(jì)算ACE抑制率。

式中：a為樣品組馬尿酸峰面積；b為對(duì)照組馬尿酸峰面積。

IC50定義為ACE抑制率達(dá)50%時(shí)的多肽質(zhì)量濃度(mg/mL)，用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件的概率單位法(probit)計(jì)算。多肽含量采用雙縮脲法測(cè)定[21]。

1.3.5 酶的篩選

取泥鰍肉10g，加水30mL，按2000U/g pro加酶量分別加入復(fù)合風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶，在上述酶的適宜條件(表1)下進(jìn)行酶解，以水解度及IC50為指標(biāo)考察0～240min內(nèi)(間隔30min)供試酶的水解進(jìn)程及酶解液對(duì)ACE的抑制作用。

表1 供試酶的作用條件Table1 Hydrolysis conditions of proteases tested in this study

1.3.6 泥鰍肉水解物的相對(duì)分子質(zhì)量分布測(cè)定

參照文獻(xiàn)[22]的方法，采用凝膠層析法測(cè)定水解物相對(duì)分子質(zhì)量分布。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選趨

圖1 5種供試酶對(duì)泥鰍肉的水解進(jìn)程Fig.1 Hydrolysis courses of loach protein by five proteases

如圖1所示，隨著酶解時(shí)間延長，泥鰍蛋白在不同蛋白酶作用下的水解度逐漸增加，達(dá)到150min后增加勢(shì)變緩。圖2顯示，未經(jīng)水解的泥鰍肉勻漿幾乎沒有ACE抑制活性。經(jīng)酶水解后，均表現(xiàn)出了一定的ACE抑制活性。其中，復(fù)合蛋白酶水解物的ACE抑制活性提高最快，但隨著水解程度的不斷推進(jìn)，ACE抑制活性呈現(xiàn)無規(guī)律的波動(dòng)，復(fù)合風(fēng)味蛋白酶也有類似的現(xiàn)象，可能是因?yàn)檫@兩種酶制劑為多種酶的復(fù)合，水解位點(diǎn)多造成的。在供試的酶中，胃蛋白酶水解物的ACE抑制活性始終較低。菠蘿蛋白酶水解物的ACE抑制活性在水解開始后就呈現(xiàn)快速上升的趨勢(shì)，在120min時(shí)達(dá)到最大(IC50=0.023mg/mL)，隨后呈現(xiàn)下降現(xiàn)象。水解度和抑制率之間沒有正相關(guān)性，這一現(xiàn)象與姚東瑞等[23]的研究結(jié)果一致，因此酶的選擇及工藝條件的優(yōu)化在制備功能肽時(shí)是非常必要的。菠蘿蛋白酶水解物表現(xiàn)出較強(qiáng)的ACE抑制活性，因此選用菠蘿蛋白酶用于下一階段的研究。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 pH值對(duì)水解物ACE抑制率的影響

調(diào)節(jié)pH值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，其他水解條件為：溫度50℃，加酶2000U/g pro，固液比1:3，酶解時(shí)間120min，測(cè)定酶解液水解度及其對(duì)ACE抑制率，結(jié)果如圖3所示。

圖3 pH值對(duì)水解物ACE抑制率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis pH on ACE inhibitory rate of loach protein hydrolysates

圖2 不同蛋白酶水解物對(duì)ACE抑制率的影響Fig.2 Effect of protease type on ACE inhibitory rate of loach protein hydrolysates

由圖3可見，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，隨pH值升高ACE抑制率呈下降趨勢(shì)，而水解度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，水解度與ACE之間出現(xiàn)不一致的現(xiàn)象，水解120min的條件下，pH6時(shí)水解物對(duì)ACE的抑制活性最高，顯然此時(shí)酶并非處在最佳的作用pH值。

2.2.2 溫度對(duì)水解物ACE抑制率的影響

設(shè)定酶解溫度為40、45、50、55、60℃，pH值為6，其他條件同2.2.1節(jié)，測(cè)定酶解液水解度及ACE抑制率，結(jié)果如圖4所示。

圖4 溫度對(duì)水解物ACE抑制率的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on ACE inhibitory rate of loach protein hydrolysates

圖4顯示，溫度對(duì)水解物的ACE抑制率影響極顯著，5℃的波動(dòng)即可引起ACE抑制率的較大波動(dòng)，在50℃時(shí)達(dá)到最大，因此選擇50℃作為正交試驗(yàn)優(yōu)化時(shí)的中心水平。

2.2.3 加酶量對(duì)水解物ACE抑制率的影響

設(shè)定加酶量為500、1000、1500、2000、2500U/g pro，溫度50℃，pH6，其他條件同2.2.1節(jié)，測(cè)定酶解液水解度及其對(duì)ACE抑制率，結(jié)果如圖5所示。

圖5 加酶量對(duì)水解物ACE抑制率的影響Fig.5 Effect of enzyme dose on ACE inhibitory rate of loach protein hydrolysates

圖5顯示，水解度隨加酶量增加而提高，而ACE抑制率在水解度達(dá)到較大值時(shí)卻降低，水解度最大時(shí)的ACE抑制率并非最大，說明肽的大小對(duì)其活性的影響是非常重要的，適宜的加酶量為1000U/g pro。

2.2.4 固液比對(duì)水解物ACE抑制率的影響

設(shè)定固液比為1:1、1:2、1:3、1:4及1:5，其他酶解條件為：加酶量1000U/g pro，pH6.0，在50℃條件下酶解120min，水解度及ACE抑制率變化如圖6所示。

圖6顯示，固液比對(duì)水解物的ACE抑制率產(chǎn)生顯著的影響，1:4時(shí)達(dá)到最高，隨著固液比的增大，底物濃度變小，水解度及抑制率均呈下降趨勢(shì)。因此，固液比為1:4是比較適宜的，此時(shí)水解度為19.6%。

圖6 固液比對(duì)水解物ACE抑制率的影響Fig.6 Effect of solid-to-liquid ratio on ACE inhibitory rate of loach protein hydrolysates

2.2.5 酶解時(shí)間對(duì)ACE抑制率的影響

設(shè)定酶解時(shí)間為30、60、90、120、150min，固液比1:4，其他條件同2.2.4節(jié)，測(cè)定酶解液水解度及ACE抑制率，結(jié)果如圖7所示。

圖7 酶解時(shí)間對(duì)水解物ACE抑制率的影響Fig.7 Effect of hydrolysis duration on ACE inhibitory rate of loach protein hydrolysates

圖7顯示，90min時(shí)水解物的ACE抑制率達(dá)到最大。隨著酶解時(shí)間延長，雖然水解度有所提高，但水解物的ACE抑制率卻呈下降趨勢(shì)。

從單因素試驗(yàn)結(jié)果來看，水解度與水解物ACE抑制率大小之間并沒有正相關(guān)關(guān)系，似乎要使ACE抑制率達(dá)到最大時(shí)，水解度應(yīng)處在某一水平。這可能是因?yàn)榛钚噪牡淖饔弥饕Q于肽鏈中暴露的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的性質(zhì)和肽的氨基酸序列，同時(shí)，水解液的ACE抑制活性是由多種結(jié)構(gòu)的肽提供的，而水解度過高或過低均可能使具有活性結(jié)構(gòu)的肽含量發(fā)生變化從而使總的活性降低，這種現(xiàn)象與許慶陵等[24]、黃艷春等[25]的結(jié)果是一致的。

2.3 酶解工藝優(yōu)化

通過SPSS 13.0軟件對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析和多重比較，結(jié)果表明pH值、溫度和固液比3個(gè)因素對(duì)水解物的ACE抑制率有顯著影響。根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用L9(34)正交表設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析見表2。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析Table2 Orthogonal array design and results

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table3 Analysis of variance for the experimental results of orthogonal array design

對(duì)表2試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析以確定各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響顯著性，結(jié)果顯示(表3)，溫度對(duì)水解物的ACE抑制率影響極顯著(P＜0.01)、固液比對(duì)水解物的ACE抑制率影響顯著(P＜0.05)，而pH值對(duì)水解物的ACE抑制率影響不顯著(P＞0.05)。

表2極差分析結(jié)果顯示，影響菠蘿蛋白酶水解物的ACE抑制率的主次因素順序是A＞C＞B，即溫度＞固液比＞pH值，溫度對(duì)酶解反應(yīng)的影響最大，固液比次之，pH值的影響最小。因?yàn)閜H值對(duì)ACE抑制率的影響不顯著，所以最佳水解條件確定為A3B3C1，即實(shí)際水解條件為溫度55℃，固液比1:3，pH6.5，時(shí)間90min，酶用量1000U/g pro。

2.4 IC50值測(cè)定結(jié)果

采用最佳酶解條件制備水解物，將凍干后的水解物用超純水配成5mg/mL的溶液，按5倍稀釋為0.000064～5mg/mL的系列質(zhì)量濃度。以質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)繪制量效關(guān)系圖，結(jié)果見圖8。經(jīng)SPSS 13.0計(jì)算(probit模型)得泥鰍肉酶解液ACE抑制率的IC50=0.0184mg/mL。

經(jīng)優(yōu)化后，泥鰍蛋白水解物的ACE抑制活性顯著提高(IC50由0.023mg/mL降至0.0184mg/mL)，說明酶解條件的優(yōu)化是非常必要的。在相同的條件下測(cè)得卡托普利的IC50為0.056μg/mL，泥鰍蛋白水解物的ACE抑制活性雖然低于卡托普利，但與其他食源性肽相比，泥鰍蛋白水解物的ACE抑制活性遠(yuǎn)高于大豆肽(1.20mg/mL)[26]、銀杏蛋白水解物(0.98mg/mL)[18]、乳酪蛋白水解物(0.0528mg/mL)[27]，也遠(yuǎn)高于其他水產(chǎn)源蛋白水解物[28]，例如大西洋鮭魚(Atlantic salmon)、銀鮭(coho salmon)、阿拉斯加鱈(Alaska pollock)和南方藍(lán)鱈(southern blue whiting)的IC50分別為5.00、3.70、2.90、3.60mg/mL。因此，菠蘿蛋白酶水解泥鰍蛋白制備ACE抑制肽效果是非常好的。

圖8 樣品質(zhì)量濃度與ACE抑制率的量效關(guān)系圖Fig.8 Relationship between mass concentration and ACE inhibitory rate of loach protein hydrolysates

2.5 泥鰍肉水解物的相對(duì)分子質(zhì)量分布

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

測(cè)定水解物相對(duì)分子質(zhì)量分布的Sephadex G-15凝膠柱參數(shù)為V0=17.95mL，Vt=39.94mL。由各標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間計(jì)算出相應(yīng)的Ve，進(jìn)而計(jì)算出有效分配系數(shù)Kav，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=-1.2895χ+4.3499，R2=0.9978。

2.5.2 泥鰍肉水解物的相對(duì)分子質(zhì)量分布及ACE抑制率

圖9 泥鰍肉酶解液Sephadex G-15層析圖Fig.9 Sephadex G-15 gel filtration chromatogram of loach protein hydrolysates

圖9、10顯示，水解物中不同相對(duì)分子質(zhì)量的肽段均具有一定的ACE抑制活性，但活性高低差別很大，主要活性肽的相對(duì)分子質(zhì)量在924左右，而其他組分的ACE抑制活性相對(duì)較弱。這種現(xiàn)象可能是因?yàn)锳CE是一類專一性相對(duì)較弱的酶，在蛋白質(zhì)經(jīng)酶解后獲得的多肽中，存在著多種ACE抑制肽類物質(zhì)，這些ACE抑制肽并非是簡(jiǎn)單的有或無[24-25]。

圖10 各分離組分的相對(duì)分子質(zhì)量和ACE抑制活性Fig.10 Relative molecular mass and ACE inhibitory rate of each fraction separated by from loach protein hydrolysates Sephadex G-15 gel filtration chromatography

3 結(jié) 論

3.1 通過對(duì)泥鰍肉酶解進(jìn)程及ACE抑制作用的研究發(fā)現(xiàn)，水解度與ACE抑制活性之間沒有正相關(guān)性，選擇適合的酶及酶解條件的優(yōu)化可能是酶法制備ACE抑制肽的關(guān)鍵。

3.2 菠蘿蛋白酶是一種比較適合于酶解泥鰍肉制備具有ACE抑制活性的活性肽水解酶，在最優(yōu)條件下制備的水解物具有很高的ACE抑制活性。

3.3 經(jīng)正交試驗(yàn)優(yōu)化的最佳酶解條件為：溫度55℃，固液比1:3，pH6.5，時(shí)間90min，酶用量1000U/g pro，在該條件下水解物對(duì)ACE抑制率的IC50為0.0184mg/mL。水解液中活性肽的相對(duì)分子質(zhì)量主要集中在924左右。

[1]OTTE J, SHALABY S M A, ZAKORA M, et al. Fractionation and identification of ACE-inhibitory peptides from α-lactalbumin and βcasein produced by thermolysin-catalysed hydrolysis[J]. International Dairy Journal, 2007, 17: 1460-1472.

[2]王金玲, 李恒星, 董曉美, 等. 酶解法生產(chǎn)降血壓肽的水產(chǎn)蛋白原料篩選研究[J]. 中國食品學(xué)報(bào), 2009, 9(3): 111-116.

[3]王瑛瑤, 王璋, 陳尚衛(wèi). 花生ACE 抑制活性肽的分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(10): 341-344.

[4]RAGHAVAN S, KRISTINSSON H G. ACE-inhibitory activity of tilapia protein hydrolysates[J]. Food Chemistry, 2009, 117: 582-588.

[5]CHIANG W D, TSOU M J, TSAI Z Y, et al. Angiotensin I-converting enzyme inhibitor derived from soy protein hydrolysate and produced by using membrane reactor[J]. Food Chemistry, 2006, 98: 725-732.

[6]WU Hao, HE Hailun, CHEN Xiulan, et al. Purification and identification of novel angiotensin-I-converting enzyme inhibitory peptides from shark meat hydrolysate[J]. Process Biochemistry, 2008, 43: 457-461.

[7]WANG Jiapei, HU Jianen, CUI Jinzhe, et al. Purification and identification of a ACE inhibitory peptide from oyster proteins hydrolysate and the antihypertensive effect of hydrolysate in spontaneously hypertensive rats [J]. Food Chemistry, 2008, 111: 302-308.

[8]LEE S H, QIAN Z J, KIM S K. A novel angiotensin I converting enzyme inhibitory peptide from tuna frame protein hydrolysate and its antihypertensive effect in spontaneously hypertensive rats[J]. Food Chemistry, 2010, 118: 96-102.

[9]欽傳光, 黃開勛, 徐輝碧. 泥鰍中的生物活性分子及其藥理作用[J].中國生化藥物雜志, 2002, 23(1): 47-48.

[10]YOU Lijun, ZHAO Mouming, CUI Chun, et al. Effect of degree of hydrolysis on the antioxidant activity of loach (Misgurnus anguillicaudatus) protein hydrolysates[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 2009 10: 235-240.

[11]凌先. 泥鰍的食用價(jià)值與藥用價(jià)值[J]. 種養(yǎng)門診, 2009, 16(5): 116.

[12]趙振山, 高貴琴, 印杰, 等. 泥鰍和大鱗副泥鰍營養(yǎng)成分分析[J]. 水利漁業(yè), 1999, 19(2): 16-17.

[13]劉孝華. 泥鰍的生物學(xué)特性及養(yǎng)殖技術(shù)[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 47 (1): 93-95.

[14]GUO Yuxin, PAN Daodong. Optimisation of hydrolysis conditions for the production of the ACE inhibitory peptides from whey protein using response surface methodology[J]. Food Chemistry, 2009, 114: 328-333.

[15]諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司, 張家港市金源生物化工有限公司,中國食品發(fā)酵工業(yè)研究所, 等. 蛋白酶制劑[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)化出版社, 2009.

[16]衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗(yàn)所. GB 5009.5—2010 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2010.

[17]候曼玲. 食品分析[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2004: 128-129.

[18]劉寧, 仇農(nóng)學(xué), 朱振寶, 等. 杏仁蛋白水解物對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制作用的研究[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(5): 249-252.

[19]劉寧, 仇農(nóng)學(xué). 堿性蛋白酶Alcalase水解杏仁蛋白制備ACE抑制肽[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工: 學(xué)刊, 2009(3): 149-152.

[20]朱迎春, 許小琴, 馬儷珍. 鯰魚骨酶解物的降血壓肽活性研究[J]. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2009, 26(1): 61-65.

[21]徐娟, 呂嘉櫪. 乳蛋白水解液中多肽含量測(cè)定方法的研究[J]. 食品科技, 2010, 35(12): 275-277.

[22]盤賽昆, 顧小紅, 湯堅(jiān), 等. 鯉魚肉酶解物清除羥自由基的研究[J].食品研究與開發(fā), 2009, 30(9): 23-27.

[23]姚東瑞, 王淑軍, 李圓圓, 等. 泥鰍肉酶解物對(duì)羥自由基的清除作用[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(21): 29-34.

[24]許慶陵, 曾慶祝. 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制肽的酶法制備[J]. 廣州大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2007, 6(6): 41-44.

[25]黃艷春, 熊善柏, 趙思明, 等. 鰱肉酶解工藝及其產(chǎn)物對(duì)大鼠ACE抑制活性的研究[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(1): 203-206.

[26]吳建平, 丁霄霖. 大豆降血壓肽的研制(I): 生產(chǎn)高活性ACE I肽酶系的篩選[J]. 中國油脂, 1998, 23(2): 49-51.

[27]MIGUEL M, CONTRERAS M M, RECIO I, et al. ACE-inhibitory and antihypertensive properties of a bovine casein hydrolysate[J]. Food Chemistry, 2009, 112: 211-214.

[28]NAKAJIMA K, YOSHIE-STARK Y, OGUSHI M. Comparison of ACE inhibitory and DPPH radical scavenging activities of fish muscle hydrolysates[J]. Food Chemistry, 2009, 114: 844-851.

Preparation of ACE Inhibitory Peptides by Bromelain Hydrolysis of Loach (Misgurnus anguillicaudatus) Protein

YAO Dong-rui，PAN Sai-kun，ZHOU Ming-qian，WANG Shu-jun，HU Jin-ling
(School of Food Engineering, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China)

The present deals with the enzymatic preparation of angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitory active peptides from loach (Misgurnus anguillicaudatus) protein. An L9(34) orthogonal array design methods based on single factor experiments was used to optimize the hydrolysis conditions for achieving maximum ACE inhibitory activity of loach protein hydrolysates. HPLC was used to determine ACE inhibitory activity of loach protein hydrolysates. Bromelain was found to be more suitable to prepare ACE inhibitory active peptides than trypsin, pepsin, flavourzyme and protamex. The optimal hydrolysis conditions were temperature of 55 ℃, solid-to-liquid ratio of 1:3, pH of 6.5, bromelain dose of 1000 U/g protein and hydrolysis duration of 90 min. The IC50 of the loach protein hydrolysate obtained under these conditions was 0.0184 mg/mL and the relative molecular weight distribution of ACE inhibitory peptides in it was mainly concentrated around 924.

Misgurnus anguillicaudatus；enzymatic hydrolysis；antihypertensive activity；angiotensin I-converting enzyme (ACE)；bromelain

Q819

A

1002-6630(2012)01-0180-06

2011-05-04

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新基金項(xiàng)目(CX09-627；CX10-328)；連云港市科技基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)計(jì)劃項(xiàng)目(CK0935)；江蘇省科技支撐計(jì)劃(農(nóng)業(yè))項(xiàng)目(BE2010399)

姚東瑞(1966—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工及漁業(yè)經(jīng)濟(jì)。E-mail：yao-dr@hhit.edu.cn