王雪青，鄧 偉，楊進(jìn)芳，毛羽聰，史中明

(天津市食品與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134)

藻藍(lán)蛋白酶解肽的分離純化及其細(xì)胞毒活性

王雪青，鄧 偉，楊進(jìn)芳，毛羽聰，史中明

(天津市食品與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134)

研究鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis)藻藍(lán)蛋白(C-phycocyanin，C-PC)及其胰蛋白酶水解肽的分離純化。采用反復(fù)凍融和超聲破碎法破碎細(xì)胞，用28～55g/100mL硫酸銨沉淀反復(fù)鹽析獲得純度(A620nm/A280nm)為2.19的藻藍(lán)蛋白，再通過(guò)羥基磷灰石(HA)柱層析和Sephacryl S-200 HR凝膠層析對(duì)其進(jìn)行純化，得到純度(A620nm/A280nm)為3.89藻藍(lán)蛋白。純化后的藻藍(lán)蛋白在40℃條件下經(jīng)胰蛋白酶酶解60min后，用DEAE-Sepharose Fast Flow柱層析對(duì)酶解肽產(chǎn)物進(jìn)行分離，收集得到4組藻藍(lán)蛋白酶解肽。采用MTT方法，研究藻藍(lán)蛋白、酶解混合液、分離的4個(gè)酶解肽組分對(duì)腫瘤細(xì)胞系HeLa和293T增殖的影響。結(jié)果顯示：肽組分1和4對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制率分別為37.71%和47.04%，而混合肽和藻藍(lán)蛋白抑制率分別為34.02%和26.03%，因此活性肽組分1和4顯示出較好的腫瘤抑制效果，而這兩種活性肽組分對(duì)正常細(xì)胞293T并無(wú)細(xì)胞毒活性，特別是組分4效果最明顯，是極具開(kāi)發(fā)潛力的保健產(chǎn)品。

藻藍(lán)蛋白；純化；酶解肽；細(xì)胞毒活性

藻藍(lán)蛋白(C-phycocyanin，C-PC)是從螺旋藻等藻體中提取的一種光合輔助色素蛋白，無(wú)毒呈藍(lán)色。許多研究報(bào)道，C-PC具有抗腫瘤[1-5]、抗輻射[6]、免疫調(diào)節(jié)[7]和保護(hù)神經(jīng)[5,8]等生理作用，因此在西方發(fā)達(dá)國(guó)家，已作為添加劑廣泛用于功能性食品和高級(jí)化妝品中。按照C-PC在特定波長(zhǎng)吸光度的比(A620nm/A280nm)大小，將其分為食品級(jí)(A620nm/A280nm≥0.5)、化妝品級(jí)(A620nm/A280nm≥2.0)和試劑級(jí)(A620nm/A280nm≥4.5)3個(gè)級(jí)別。不同級(jí)別的C-PC，價(jià)格和用途也不相同。高純度的C-PC可制成熒光探針，已在臨床診斷和生物分析檢測(cè)領(lǐng)域中顯示出良好的應(yīng)用開(kāi)發(fā)前景。但由于C-PC提取純化工藝相對(duì)復(fù)雜且成本較高，加之其穩(wěn)定性較差，許多環(huán)境因素如溫度、光照、pH值和一些食品添加劑均能造成其變性降解[9-10]，限制了C-PC的應(yīng)用。

一些生物活性肽常以非活性狀態(tài)存在于蛋白質(zhì)中，這些蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)蛋白酶的水解作用，使隱藏于其中的活性肽釋放出來(lái)，有可能發(fā)揮出比原有蛋白更多生物活性[11-13]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)口服或灌胃后，C-PC可顯著影響機(jī)體的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，如通過(guò)調(diào)節(jié)輔助性T細(xì)胞Th1和Th2細(xì)胞因子的表達(dá)糾正失衡的Th1/Th2的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)[14]，調(diào)節(jié)自身免疫平衡狀態(tài)和炎癥反應(yīng)；通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞集落刺激因子(CSF)[15]、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)及其受體(FGFR-1) 、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)及其受體(GF-1R)的表達(dá)，調(diào)節(jié)維持多種細(xì)胞尤其是神經(jīng)細(xì)胞的再生修復(fù)[16]；通過(guò)明顯下調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和白介素IL-6的表達(dá)，抑制神經(jīng)元的凋亡[17]，以此調(diào)節(jié)免疫功能和炎癥反應(yīng)，并加強(qiáng)其他細(xì)胞因子的效果。由此推測(cè)，C-PC可能正是通過(guò)腸胃的消化作用，使其內(nèi)的功能肽段作用的結(jié)果。本課題組發(fā)現(xiàn)，在特定條件下經(jīng)胰蛋白酶水解的C-PC得到的酶解產(chǎn)物具有比C-PC本身更高抗腫瘤活性[18]。

本實(shí)驗(yàn)圍繞C-PC的分離純化和純化的C-PC經(jīng)過(guò)酶解處理，柱層析分離，檢測(cè)不同組分的抗腫瘤活性進(jìn)行一系列研究，為C-PC的深加工以及抗癌藥物的開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鈍頂螺旋藻粉 內(nèi)蒙怡健生物制品有限公司。

羥基磷灰石(HA)粉 四川大學(xué)生物材料工程研究中心；細(xì)胞株：人宮頸癌細(xì)胞HeLa、表達(dá)SV40大T抗原的人腎上皮細(xì)胞293T取自中科院北京生物制品研究所；丙烯葡聚糖凝膠(Sephacryl S-200 HR)、DEAE瓊脂糖凝膠(DEAE Sepharose Fast Flow)、葡聚糖凝膠(Sephadex G-25) 美國(guó)GE公司；DMEM培養(yǎng)基 美國(guó)Gibico公司；四甲基噻唑藍(lán)(MTT) 中國(guó)醫(yī)科院血液研究所；胎牛血清(FBS) 蘭州民海生物工程有限公司；胰蛋白酶(Trypsin) 美國(guó)Sigma公司；二甲基亞砜(DMSO)天津匯英化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

YC-2型低溫層析冷柜 北京長(zhǎng)流科學(xué)儀器有限公司；CO2培養(yǎng)箱SL型 Shellab公司；高速冷凍離心機(jī)美國(guó)Sigma公司；酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Labsystems公司；倒置顯微鏡 北京賽百奧科貿(mào)中心；SW-CJ-1F單人雙面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藻藍(lán)蛋白的提取

方案一(傳統(tǒng)的二步鹽析法)：1)細(xì)胞破碎：取20g螺旋藻粉溶于400mL的10mmol/L PBS緩沖液中，浸泡4h，于-20～4℃之間反復(fù)凍融4次，每次融化后進(jìn)行超聲破碎，條件為：功率400W，時(shí)間6s，間隔15s，60次。4℃、10000r/min離心30min，棄沉淀取上清。2)鹽析：上清液經(jīng)28g/100mL飽和硫酸銨沉淀，4℃、10000r/min離心30min，取上清。上清液由55g/100mL飽和硫酸銨沉淀，相同條件離心，棄上清。沉淀溶于PBS緩沖液，透析除鹽，得到藻藍(lán)蛋白粗提液。

方案二(改進(jìn)的四步鹽析法)：1)細(xì)胞破碎：取40g螺旋藻粉溶于400mL的10mmol/L PBS緩沖液中，過(guò)程同方案一。2)鹽析：按照方案一得到的藻藍(lán)蛋白粗提液，再按照方案一的操作條件，進(jìn)行兩次沉淀，兩次離心，得到方案二的藻藍(lán)蛋白粗提液。

兩種方案中藻藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度與純度的計(jì)算：對(duì)方案一和方案二上清液中蛋白含量較高的粗提液適量稀釋后，分別測(cè)定其上清液在波長(zhǎng)620nm和652nm處的吸光度，并按以式(1)計(jì)算藻藍(lán)蛋白的質(zhì)量濃度和純度[15]。藻藍(lán)蛋白的純度用A620nm/A280nm比值來(lái)表示。

式中：ρ為藻藍(lán)蛋白的質(zhì)量濃度/(mg/mL)；A620nm為藻藍(lán)蛋白的特征吸光度；A652nm為別藻藍(lán)蛋白的特征吸光度。

1.3.2 藻藍(lán)蛋白的純化

1.3.2.1 羥基磷灰石柱層析

用5mmol/L pH7.0 PBS緩沖液預(yù)平衡層析柱，然后加入粗蛋白提取液上柱，以5～150mmol/L pH7.0的PBS緩沖液加0.1mol/L的NaCl進(jìn)行濃度梯度洗脫，用紫外檢測(cè)儀在波長(zhǎng)280nm處獲得吸收峰位置及強(qiáng)度信息，分部收集洗脫液并計(jì)算A620nm/A280nm值。獲得的蛋白洗脫液用PEG 20000濃縮。

1.3.2.2 Sephacryl S-200 HR柱層析

用10mmol/L pH7.0 PBS緩沖液預(yù)平衡層析柱，經(jīng)HA柱純化的蛋白液上柱，用0.02mmol/L PBK緩沖液＋0.1mol/L NaCl緩沖液洗脫，于280nm波長(zhǎng)處獲得吸收峰位置及強(qiáng)度信息，分部收集洗脫液。取藻藍(lán)蛋白部分，經(jīng)Sephadex G-25脫鹽、凍干，-20℃保存。

1.3.3 藻藍(lán)蛋白活性肽的提取

藻藍(lán)蛋白酶解肽的制備參照楊瀅瀅[19]的方法。具體操作如下：將純化后的藻藍(lán)蛋白配成質(zhì)量濃度為100μg/mL溶液，用胰蛋白酶進(jìn)行酶解處理，操作溫度為40℃，pH8.0，酶與底物比1:10，反應(yīng)時(shí)間60min。酶解過(guò)程不斷攪拌并控制pH值，以1mmol苯甲基磺酰氟(PMSF)終止反應(yīng)，凍干。

酶解產(chǎn)物的分離采用DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換柱層析和Sephadex G-25凝膠過(guò)濾柱層析。DEAE Sepharose FF柱層析，用緩沖液A：20mmol/L PBS (pH6.8)，緩沖液B：20mmol/L PBS(pH6.8)+1.0mmol/L的NaCl，洗脫程序?yàn)椋河镁彌_液A平衡層析柱，緩慢上樣，用緩沖液A洗脫，待樣品完全流穿，再用緩沖液A與B的梯度洗脫，最后用緩沖液B洗脫?？刂屏魉伲?80nm波長(zhǎng)處檢測(cè)流出液洗脫峰。

經(jīng)DEAE Sepharose FF分離出的組分蛋白，經(jīng)濃縮后，Sephadex G-25除鹽，得到的樣品凍干保存。

1.3.4 細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn)

取生長(zhǎng)良好的對(duì)數(shù)期HeLa細(xì)胞，制成濃度為1.5× 105個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，每孔加入100μL于96孔板中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白：用于調(diào)零；陰性對(duì)照組：只加 0.01mol/L PBS 10μL；陽(yáng)性對(duì)照組：100μg/mL 5-氟尿嘧啶(5-Fu) 10μL；實(shí)驗(yàn)組：1μg/mL C-PC 10μL，酶解混合多肽和4組分離出的酶解產(chǎn)物10μL，每孔補(bǔ)培養(yǎng)基之總體積100μL。不同處理組加樣48h后棄去上清液，加入5mg/mL MTT，每孔10μL，再補(bǔ)加90μL的PBS以使MTT終質(zhì)量濃度為0.5mg/mL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄上清液，加入加DMSO 150μL/孔，振蕩混勻后，在酶標(biāo)儀上測(cè)定570nm波長(zhǎng)處的吸光度，按式(2)計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取工藝對(duì)藻藍(lán)蛋白提取效果的影響

利用傳統(tǒng)的二步鹽析法，得到的藻藍(lán)蛋白粗提物其純度值(A620nm/A280nm)并不高，僅為1.35，因而要達(dá)到純度要求需在后續(xù)純化過(guò)程中增加操作步驟。本實(shí)驗(yàn)為減輕后期的純化工作，又綜合考慮總操作時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，在藻藍(lán)蛋白的粗提取過(guò)程中利用反復(fù)兩次的二步鹽析操作對(duì)其進(jìn)行鹽析提取。提取工藝效果見(jiàn)表1。

表1 不同鹽析工藝對(duì)藻藍(lán)蛋白提取率和純度的影響Table1 Effect of salting-out on the purity of C-PC

由表1可知，4步鹽析工藝與二步鹽析工藝相比，操作過(guò)程中在藻液比提高一倍的基礎(chǔ)上，獲得了藻藍(lán)蛋白粗提取產(chǎn)物，且蛋白質(zhì)提取率相差不大。藻液比相比傳統(tǒng)分離濃度要大，加之硫酸銨飽和溶液會(huì)對(duì)溶解在其中的蛋白起到保護(hù)作用，因此此操作更加適合大量提取。

盡管增加了提取步驟，但這一步驟耗費(fèi)的過(guò)程并不繁瑣，而且藻藍(lán)蛋白在硫酸銨溶液中能夠得到保護(hù)，并不會(huì)因時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而產(chǎn)生降解。而粗提過(guò)程能夠?qū)υ逅{(lán)蛋白大量制備，其純度的提高可明顯減少后續(xù)純化的工作量，對(duì)藻藍(lán)蛋白的大規(guī)模提取和純化工作有著重要意義。

2.2 藻藍(lán)蛋白的純化工藝研究

2.2.1 羥基磷灰石柱層析對(duì)藻藍(lán)蛋白的分離效果

圖1 藻藍(lán)蛋白粗品經(jīng)羥基磷灰石柱層析洗脫曲線Fig.1 Elution profile of crude C-PC on HA column

粗蛋白經(jīng)過(guò)羥基磷灰石柱層析，磷酸鹽緩沖液梯度洗脫，結(jié)果見(jiàn)圖1。經(jīng)分光光度計(jì)檢測(cè)A620nm/A280nm，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)組分藻藍(lán)蛋白主要集中在峰1和峰2。峰3和峰4含有藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白，峰5為別藻藍(lán)蛋白。峰1和峰2合并，記為組分I。經(jīng)檢測(cè)，組分I的純度為：A620nm/A280nm＝3.18。

2.2.2 Sephacryl S-200 HR柱凝膠層析對(duì)藻藍(lán)蛋白的純化

圖2 Sephacryl S-200 HR柱層析洗脫曲線Fig.2 Elution profile of peptide fraction I on Sephacryl S-200 HR gel column

收集峰1和峰2的組分，經(jīng)過(guò)Sephacryl S-200 HR柱凝膠層析得到4個(gè)洗脫峰，結(jié)果見(jiàn)圖2。峰1呈深藍(lán)色，主要成分為藻藍(lán)蛋白。收集后經(jīng)檢測(cè)，藻藍(lán)蛋白純度為：A620nm/A280nm＝3.89。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)藻藍(lán)蛋白的柱層析純化制備工藝多為兩種以上不同分離原理的柱層析交替使用，且多為凝膠層析與吸附層析的3步以上交替純化過(guò)程才能制備出純度在分析級(jí)以上的高純度藻藍(lán)蛋白。本研究由于先前粗提過(guò)程中已將藻藍(lán)蛋白純度提高到了2.19以上，因此在柱層析純化過(guò)程中僅使用了兩步過(guò)程已使得藻藍(lán)蛋白純度達(dá)到了3.8以上。

2.2.3 全波長(zhǎng)掃描法鑒定純化后的藻藍(lán)蛋白

為進(jìn)一步確定純化出的藻藍(lán)蛋白純度，對(duì)其進(jìn)行紫外-可見(jiàn)全波長(zhǎng)掃描。由圖3可知，藻藍(lán)蛋白在280、360nm和620nm波長(zhǎng)處均有特征吸收峰，其最大吸收波長(zhǎng)為620nm。再?gòu)娜ㄩL(zhǎng)掃描的數(shù)據(jù)中分別找出620nm與280nm波長(zhǎng)處所對(duì)應(yīng)的截距，得到藻藍(lán)蛋白的純度為3.89。

圖3 藻藍(lán)蛋白的全波長(zhǎng)掃描曲線Fig.3 Full wavelength scanning spectrum of C-PC

2.3 DEAE Sepharose FF柱層析對(duì)藻藍(lán)蛋白酶解肽的分離純化

圖4 藻藍(lán)蛋白酶解多肽的DEAE Sepharose FF柱層析洗脫曲線Fig.4 Elution profile of C-PC hydrolysate on DEAE Sepharose FF column

酶解后的藻藍(lán)蛋白多肽混合物經(jīng)DEAE Sepharose FF柱層析分離，得到洗脫曲線見(jiàn)圖4。綜合波長(zhǎng)280nm吸收峰與洗脫時(shí)間可判斷，其中，峰1與峰6為洗脫過(guò)程中的雜質(zhì)組分，峰2、3、4、5這4個(gè)組分，分別標(biāo)記為T1、T2、T3、T4。

由于本實(shí)驗(yàn)室前期的研究中，已通過(guò)正交法得到了藻藍(lán)蛋白功能肽的最佳酶解條件，并且酶解出的藻藍(lán)蛋白活性肽的片段分子質(zhì)量較小，應(yīng)在5kD以下。因此本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上采用目前較流行的DEAE Sepharose Fast Flow弱陰離子交換層析對(duì)混合多肽產(chǎn)物進(jìn)行分離。分離出的各組分再通過(guò)Sephadex G-25進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析純化，同時(shí)進(jìn)行脫鹽，在此過(guò)程中，既根據(jù)洗脫峰對(duì)目標(biāo)肽組分進(jìn)行純化，同時(shí)又可除去分子質(zhì)量過(guò)小的黃綠色小分子和無(wú)機(jī)鹽，使分子篩純化與除鹽過(guò)程一并進(jìn)行。

2.4 藻藍(lán)蛋白、酶解肽及其各分離組分對(duì)HeLa細(xì)胞的細(xì)胞毒活性

藻藍(lán)蛋白、酶解混合肽(標(biāo)記為TX)、酶解肽組分1～4(標(biāo)記為T1～T4)及5-Fu(已知的抗癌藥物)作用質(zhì)量濃度均為100μg/mL，作用時(shí)間為30h，研究藻藍(lán)蛋白及其活性肽樣品對(duì)HeLa細(xì)胞和正常細(xì)胞293T的作用，并與5-Fu進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 藻藍(lán)蛋白、酶解混合肽、酶解肽組分1～4及5-Fu對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Table2 Effects of C-PC, its hydrolysate, peptide fractions I through IV and 5-Fu on cell growth

從表2可知，在質(zhì)量濃度達(dá)到100μg/mL時(shí)，酶解肽組分1、2、3、4對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制率分別達(dá)到37.71%、24.08%、27.88%和47.04%，混合酶解肽的抑制率34.02%，藻藍(lán)蛋白的抑制率為26.03%，5-Fu抑制率為54.92%。分離后的酶解肽組分1和組分4的抑制率均高于混合酶解肽，尤其是組分4顯著比混和酶解肽與藻藍(lán)蛋白的抑制率要高，接近于陽(yáng)性對(duì)照組。而相同濃度下的酶解肽分離組分、混合肽、藻藍(lán)蛋白均對(duì)正常細(xì)胞293T的生長(zhǎng)沒(méi)有表現(xiàn)出任何抑制作用，反而有微弱的促進(jìn)作用，促進(jìn)增殖率從18.02%到28.67%不等，實(shí)驗(yàn)結(jié)果反映出藻藍(lán)蛋白及其酶解肽對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有抑制活性。而抗腫瘤藥物5-Fu會(huì)抑制293T細(xì)胞的生長(zhǎng)，抑制率達(dá)到18.36%，表現(xiàn)出一定的正常細(xì)胞毒性，因此藻藍(lán)蛋白及其酶解肽具有選擇性的細(xì)胞毒活性，而目前的化療藥物，如5-Fu，是無(wú)法做到的。相比之下，藻藍(lán)蛋白酶解肽T4則顯示出無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)。

圖5 藻藍(lán)蛋白酶解肽混合物的全波長(zhǎng)掃描圖Fig.5 Full wavelength scanning spectrum of C-PC hydrolysate

圖6 酶解肽T4的全波長(zhǎng)掃描圖Fig.6 Full wavelength scanning spectrum of peptide T4

為了進(jìn)一步了解組分4與混合肽一些特性，分別對(duì)同樣質(zhì)量濃度的組分4與混合肽作了全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果如圖5、6所示。藻藍(lán)蛋白酶解肽在280、360nm和620nm波長(zhǎng)處有特征吸收峰，這一點(diǎn)和酶解前的藻藍(lán)蛋白(圖3)類似。但620nm波長(zhǎng)處的吸收峰強(qiáng)度明顯減弱，而280nm和360nm波長(zhǎng)處的吸收峰強(qiáng)度增強(qiáng)，且超過(guò)了620nm波長(zhǎng)處的吸收峰強(qiáng)度。這可能是因?yàn)槊附馄茐牧嗽逅{(lán)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)引起的光譜性質(zhì)變化。同時(shí)，經(jīng)過(guò)分離純化的肽組分4與混合肽相比，在紫外區(qū)吸收光譜存在顯著差異。同樣質(zhì)量濃度條件下，在360nm處吸收峰強(qiáng)度增強(qiáng)，且在280nm波長(zhǎng)處吸收峰明顯減弱并在接近200nm處多出一個(gè)吸收峰，經(jīng)數(shù)據(jù)測(cè)量，其在紫外區(qū)的3個(gè)特征吸收峰分別在228、276nm和356nm處。純化后的T4與混合肽在光譜掃描曲線的差異也在一定程度上反映了分離純化的效果。

在藻藍(lán)蛋白酶解產(chǎn)物研究中，黃蓓等[20]報(bào)道了3種經(jīng)過(guò)胰蛋白酶水解的藻藍(lán)蛋白色素肽(其分子質(zhì)量為17.4、7.72kD和6.6kD)，并研究了其對(duì)小鼠肉瘤細(xì)胞S180的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)和荷瘤小鼠的光動(dòng)力學(xué)抗腫瘤(photodynamic therapy，PDT)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其具有良好體外腫瘤抑制效果和PDT效果。經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)藻藍(lán)蛋白酶解工藝條件和對(duì)腫瘤細(xì)胞研究對(duì)象的摸索，發(fā)現(xiàn)相同酶解條件的產(chǎn)物對(duì)不同的腫瘤細(xì)胞系作用差別很大，且用兩種蛋白酶通過(guò)正交試驗(yàn)等方法得到了抑制HeLa和B16細(xì)胞增殖的藻藍(lán)蛋白最佳酶解條件[20]，本實(shí)驗(yàn)采用胰蛋白酶酶解藻藍(lán)蛋白，以HeLa細(xì)胞為作用對(duì)象，以期找到藻藍(lán)蛋白分子中包含的相應(yīng)抗腫瘤活性肽。本實(shí)驗(yàn)采用的鈍頂螺旋藻其α和β亞基的分子質(zhì)量分別為17.0kD和19.6kD，通過(guò)對(duì)T4的HPLC液相色譜分析顯示T4主要由兩個(gè)組分，Maldi-TOF-MS肽譜分析(結(jié)果未顯示)，有兩個(gè)組分的信號(hào)明顯高于其他組分，且這兩個(gè)成分的分子質(zhì)量分別為1038.459D和1151.556D。根據(jù)藻藍(lán)蛋白的α和β亞基的氨基酸序列與結(jié)構(gòu)以及胰蛋白酶對(duì)于賴氨酸(K)和精氨酸(R)殘基中的羧基特定作用位點(diǎn)，得知α和β亞基各應(yīng)具有18個(gè)酶切位點(diǎn)，因此在本實(shí)驗(yàn)理論指導(dǎo)的酶解工藝下和初步分析測(cè)定表明，酶解肽組分4的分子質(zhì)量明顯小于5kD。

此外，本實(shí)驗(yàn)僅是應(yīng)用胰蛋白酶簡(jiǎn)單模擬體內(nèi)環(huán)境對(duì)藻藍(lán)蛋白進(jìn)行酶解加工研究，而當(dāng)藻藍(lán)蛋白被食用后，經(jīng)過(guò)腸胃道更復(fù)雜的消化作用，進(jìn)而影響機(jī)體的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，正應(yīng)是其內(nèi)的功能肽段作用暴露出來(lái)作用的結(jié)果。因此深入研究藻藍(lán)蛋白活性肽段的結(jié)構(gòu)特性及其作用機(jī)制，具有很重要的意義。本實(shí)驗(yàn)室后期將對(duì)T4活性肽進(jìn)行進(jìn)一步深入分析與鑒定工作。

3 結(jié) 論

采用改進(jìn)的鹽析工藝對(duì)藻藍(lán)蛋白粗提液反復(fù)鹽析，得到純度為A620nm/A280nm=2.19的藻藍(lán)蛋白粗提物，后經(jīng)羥基磷灰石柱層析和Sephacryl S-200 HR柱層析純化，得到純度為A620nm/A280nm=3.89的藻藍(lán)蛋白。

用胰蛋白酶水解得到的藻藍(lán)蛋白酶解肽，經(jīng)DEAE Sepharose FF柱層析分離并經(jīng)純化得到4個(gè)組分。其對(duì)HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率分別為37.71%、24.08%、27.88%和47.04%，混合肽抑制率34.02%，藻藍(lán)蛋白的抑制率為26.03%。組分1和4的抑制率高于混合肽，其中組分4作用效果最理想，且對(duì)正常細(xì)胞293T無(wú)抑制作用，為潛在的抗腫瘤活性肽組分。

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Purification and Cytotoxicity of C-Phycocyanin(C-PC) from Spirulina platensis and Its Tryptic Peptides

WANG Xue-qing，DENG Wei，YANG Jin-fang，MAO Yu-cong，SHI Zhong-ming
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

This paper deals with the separation, purification and cytotoxicity of C-phycocyanin (C-PC) from Spirulina platensis and its tryptic peptides. Repeated freezing and thawing coupled with ultrasonic treatment was used for disrupting the cell wall of Spirulina platensis. The purity (A620nm/A280nm) of C-PC was 2.19 after fractional precipitation by 28-55 g/100 mL (NH4)2SO4 and could reach 3.89 after further purification by sequential chromatography on hydroxylapatite (HA) column and Sephacryl S-200 HR gel column. The purified C-PC was hydrolyzed by trypsin at 40 ℃ for 60 min. Four peptides were obtained from the hydrolysate of C-PC by DEAE-Sepharose Fast Flow column chromatography. The cytotoxicity of C-PC and its hydrolysate as well as the 4 peptides on HeLa and 293T cells was evaluated by MTT assay. The results showed that the inhibition rates of peptide fractions I and IV, C-PC hydrolysate and C-PC on the growth of HeLa cells were 37.71%, 47.04%, 34.02% and 26.03%, respectively. Therefore, peptide fractions I and IV revealed obvious suppressive effect on the proliferation of cancer cells, while neither of them had cytotoxicity on 293T cells. Moreover, peptide fraction IV had the strongest tumor suppression activity, indicating a great potential to be developed as health-care products.

C-phycocyanin；purification；hydrolyzed peptide；cytotoxicity

R284.2；R151.41

A

1002-6630(2012)01-0136-05

2011-07-20

天津市基礎(chǔ)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(08JCZDJC16600)；天津商業(yè)大學(xué)SRT項(xiàng)目(2011-57)

王雪青(1964—)，女，教授，博士，主要從事天然活性物質(zhì)的研究與開(kāi)發(fā)。E-mail：wxqing@tjcu.edu.cn