杜 寧，許甜甜，李先富，夏志華，陳 軍

(上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234)

廢棄食用菌栽培塊中纖維素酶的提純工藝研究

杜 寧，許甜甜，李先富，夏志華，陳 軍*

(上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234)

利用廢棄食用菌栽培塊通過浸提、膜濃縮、鹽析和雙水相萃取等方法提取加工工業(yè)級和高純度纖維素酶制劑。結(jié)果表明：采用含體積分數(shù)0.2% Triton X-100的pH5.0、0.2mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液作為酶浸提液，在25℃浸提3h條件下可以抽提出102.64U/mL的纖維素酶溶液，再在質(zhì)量分數(shù)60%的(NH4)2SO4飽和度條件下可回收65.54%的纖維素酶總活力，制備成酶活力達到2865.47U/mL的工業(yè)級纖維素酶制劑；再經(jīng)質(zhì)量分數(shù)22%聚乙二醇6000(PEG6000)-20%(NH4)2SO4雙水相體系在pH5.5、7mmol/L NaCl條件下常溫萃取，可獲得酶活力為10208.46U/mL，酶比活力106.62U/mg的高純度纖維素酶，酶總活力得率為51.22%，純度是浸提液的12.85倍。

廢棄食用菌栽培塊；纖維素酶；雙水相萃??；提取純化

我國年產(chǎn)食用菌約為1000萬t，占世界產(chǎn)量的70%以上，每年產(chǎn)生大量食用菌栽培廢料(spent mushroom compost，SMC)，而目前這些廢料大多是通過堆積或燃燒方式加以處理, 既浪費了資源，又對環(huán)境造成了嚴重的污染[1]。近年來，對SMC的利用已經(jīng)開展了一些有益的探索，如Bisaria 等[2-4]利用SMC發(fā)酵制備燃料沼氣；Sochtig等[5-7]利用SMC加工有機肥用于園藝和食用菌的生產(chǎn)；Chiu等[8-10]成功地利用SMC生物降解有害物質(zhì)。此外，有關(guān)SMC中的生物活性物質(zhì)分析討論也有不少報道[11-15]。

食用菌生長過程中菌絲體會分泌大量纖維素酶來分解栽培料中的纖維素物質(zhì)，以獲得生長需要的碳源和能源[16]。在菌菇培養(yǎng)時期纖維素酶活性一般不易失活，整個栽培期間栽培料中會積累較多的纖維素酶活力。因此，在菌菇收獲后的廢棄栽培塊中通常含有一定活力的纖維素酶，而從工藝上研究廢棄栽培塊中纖維素酶回收的報道并不多見[17-18]。目前商品纖維素酶的來源主要是通過發(fā)酵法來生產(chǎn)的，生產(chǎn)成本較為昂貴。本實驗通過生化分離技術(shù)將積累在SMC中的纖維素酶提取加工精制成為商品酶制劑，為這一規(guī)?？捎^的廢棄物資源的開發(fā)利用提供資料。

1 材料與方法

1.1 材料

香菇廢棄栽培塊來源于上海市奉賢現(xiàn)代農(nóng)業(yè)園區(qū)工廠化食用菌生產(chǎn)中心。

1.2 儀器與設(shè)備

GL-20G高速冷凍離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；Millipore納濾超濾反浸膜系統(tǒng) 上海摩速爾公司；高效液相層析系統(tǒng) 上海青浦滬西儀器；UV1000型紫外分光光度計 上海天美科技公司。

1.3 方法

1.3.1 SMC的預(yù)處理

收取食用菌工廠丟棄的已經(jīng)收獲3～6茬香菇的SMC，切除霉變及腐爛部分，挑選不同批次的SMC混合碾壓粉碎備用。測定不同老熟程度的SMC水分含量、纖維素酶(CMCase)活力和蛋白質(zhì)含量。

1.3.2 纖維素酶的提取實驗

設(shè)置6組纖維素酶浸提液，分別為：去離子水；0.5g/100mL NaCl溶液；0.2mol/L pH5.0乙酸-乙酸鈉緩沖液；0.2mol/L pH5.0乙酸-乙酸鈉緩沖液＋體積分數(shù)1%甘油；0.2mol/L pH5.0乙酸-乙酸鈉緩沖液＋體積分數(shù)0.2% Triton X-100；0.2mol/L pH5.0乙酸-乙酸鈉緩沖液＋體積分數(shù)1%甘油＋體積分數(shù)0.2% Triton X-100。

取SMC加入不同的浸提液，攪拌維持相應(yīng)時間后用2層紗布過濾至常壓下液體自然濾盡，濾液經(jīng)5000r/min離心10min，得到浸提酶液。測量浸提酶液的體積、纖維素酶活力和蛋白質(zhì)含量。

正交試驗優(yōu)化浸提條件設(shè)定：因為4、10℃是生物活性物質(zhì)提取經(jīng)常采用的穩(wěn)定溫度環(huán)境，25℃是常溫環(huán)境；pH值以纖維素酶的最適pH值為依據(jù)。料液比選擇在料液混合液的可流動性比例范圍內(nèi)，所以分別以浸提溫度(4、10、25℃)、浸提液pH值(4.5、5.0、5.5)、浸提時間(1、3、5h)和料液比(0.2:1、0.3:1、0.4:1)在最適浸提液中利用正交試驗優(yōu)化浸提條件。

1.3.3 粗酶的制備

取浸提酶液經(jīng)截留分子質(zhì)量為10000D的中空纖維膜過濾器濃縮至原體積的1/5后，緩緩加入固體硫酸銨粉末至不同的飽和度，分段鹽析蛋白，每鹽析段經(jīng)10℃、10000r/min離心20min，得到固體酶泥。將固體酶泥加少量pH5.0，0.2mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液溶解，測量酶液體積、酶活力和蛋白質(zhì)含量。

1.3.4 纖維素酶的雙水相萃取純化

雙水相相圖的繪制參照朱建星等[19]方法，25℃時以40%的(NH4)2SO4溶液逐滴加入到10g 40%的聚乙二醇6000(PEG6000)的溶液中，直到出現(xiàn)混濁，記下此時的體系組成。再向混濁的體系中加入1g 0.2mol/L的pH5.0乙酸緩沖液，搖勻，待溶液變清后重復(fù)上述操作。將所記錄的體系組成以PEG6000的質(zhì)量分數(shù)為縱坐標，(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)為橫坐標作圖，即得雙結(jié)點曲線。

用PEG6000和(NH4)2SO4建立酶的雙水相萃取體系，依據(jù)上述雙結(jié)線繪制的雙水相形成特征，按體系總質(zhì)量為10g，粗酶液(鹽析沉淀透析除鹽后的酶液)量為2g。稱取一定量40% PEG6000溶液和40% (NH4)2SO4溶液及pH5.0、0.2mol/L的乙酸緩沖液混合配制成不同雙水相體系組成，6000r/min離心5min促進分相。分別測出上下相的體積和酶活力，計算分配系數(shù)，確定最適萃取纖維素酶的雙水相萃取體系組成。雙水相系統(tǒng)中的分配系數(shù)k定義為：

式中：Ca為上相液酶活力/(U/mL)；Cb為下相液酶活力 /(U/mL)。

下相酶的得率Y下相采用百分含量形式表示：

式中：Ca為上相液酶活力/(U/mL)；Cb為下相液酶活力/(U/mL)；Va為上相液體積/mL；Vb為下相液體積/mL；R為上下相溶液體積的比值；Y為酶回收率/%；k為分配系數(shù)。

1.3.5 提取過程指標測定

SM C含水量的測定：SM C栽培塊粉碎后稱取200g，置于105℃電熱干燥箱中烘干約3h至質(zhì)量恒定，冷至室溫后稱量栽培塊干質(zhì)量，計算栽培塊基質(zhì)含水量。

式中：m1為SMC濕質(zhì)量/g；m2為SMC干質(zhì)量/g。

固體物質(zhì)溶出度分析：用電子天平稱量30mL抽提液的質(zhì)量，放入105℃的烘箱內(nèi)3h，冷卻后稱質(zhì)量，測其固體物質(zhì)溶出度(%，m/m)。

纖維素酶(CMCase)活力的測定參考Han等[17]方法。在3mL 0.2mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH4.8)中加入1mL 0.5%的羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液作底物，恒溫40℃后，加酶液1mL反應(yīng)，保持反應(yīng)10min，加2mL 3,5-二硝基水楊酸顯色劑100℃水浴顯色10min后，在550nm波長處測定吸光度，并對照標準葡萄糖曲線查得葡萄糖含量，計算酶活力。

酶活力單位的定義：實驗反應(yīng)條件下，以1mL酶液在1min內(nèi)水解生成1μg葡萄糖為1個酶活力單位(U)。

式中：G為測出顯色液吸光度A550nm在葡萄糖曲線上查得的葡萄糖質(zhì)量/mg；n為酶的稀釋倍數(shù)；1000為mg與μg單位換算；10為反應(yīng)時間/min。

蛋白質(zhì)含量測定采用Bradford法[20]。用考馬斯亮藍G250與酶提取液反應(yīng)顯色，為避免PEG等的干擾，以相同組分但不含蛋白的溶液為空白對照，在595nm波長處比色測定吸光度，以牛血清白蛋白為標準蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同老化度的SMC中纖維素酶活力差異比較

栽培基質(zhì)中纖維素酶的累積與菌菇生理狀態(tài)及基質(zhì)的營養(yǎng)物質(zhì)殘留情況有密切關(guān)系，實驗分別選取已收獲3～6茬香菇的SMC塊料，測定其中的酶含量及溶出度，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同老化度的SMC中纖維素酶活力的比較Fig.1 Comparison of cellulase activity from SMC with various ages

從圖1可以看出，不同老化程度的SMC中都殘留一定含量的纖維素酶，其中，收獲5茬后的SMC中CMCase活力最高，達到162.56U/mL，含有的總蛋白質(zhì)量相對較少，但隨著栽培塊的老化，在第6茬中的酶活力顯著下降。又由于栽培料被利用時間的延長，固體物質(zhì)在浸出液中的溶出度有所增加，這可能會增加酶分離純化的復(fù)雜性。

2.2 浸出液組成對纖維素酶提取率的影響

根據(jù)蛋白質(zhì)在提取過程中對環(huán)境因素、穩(wěn)定因子及增溶性的要求，酶的浸提實驗以第5茬SMC為材料，用6種不同組成的浸出液在室溫下浸提1h，纖維素酶浸出結(jié)果如圖2所示。

由圖2 可以看出，不同浸出液對纖維素酶及蛋白質(zhì)的抽提效果有一定的差異，其中NaCl溶液(b)有較小的增溶蛋白作用，適宜的緩沖液(c)更有利于酶活力的保持，由于纖維素酶活力相對較穩(wěn)定，添加溫度保護劑甘油(d)對提取作用不大，適量的蛋白增溶劑Triton X-100(e)對纖維素酶的浸提效果最好，酶活力達到了102.64U/mL，蛋白質(zhì)的溶出度也對應(yīng)有所提高，而同時添加甘油和Triton X-100(f)與e的提取差別不明顯，因此，最適抽提液組成選擇e。

圖2 浸出液組成對纖維素酶提取率的影響Fig.2 Effect of extraction solvents on the activity of cellulase

2.3 纖維素酶提取條件優(yōu)化分析

分別以浸出溫度、浸出液pH值、浸出時間和料液比在浸出液(e)基礎(chǔ)上利用正交試驗優(yōu)化纖維素酶的提取條件，結(jié)果如表1所示。

表1 纖維素酶浸出條件優(yōu)化正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table1 Orthogonal array design and results for optimizing cellulase extraction from SMC

由表1可以發(fā)現(xiàn)，酶提取條件中影響酶溶出的主要因素是浸提溫度，25℃時酶溶出效果最好。其次是浸出時間，3～5h酶的溶出情況較好；而浸出液pH值和料液比的調(diào)整對酶的浸出率影響并不顯著，因此，實驗最終選擇以0.2mol/L pH5.5乙酸-乙酸鈉緩沖液+體積分數(shù)0.2% Triton X-100為浸出液，料液比為0.3:1，25℃浸提3～5h為條件從SMC中提取纖維素酶，驗證實驗表明浸提液CMCase活力可以達到134.62U/mL，比優(yōu)化前的102.64U/mL增加了33.11%。

2.4 纖維素酶粗酶制劑制備過程分析

SMC浸提液中酶濃度較低，雜質(zhì)含量高，經(jīng)膜濃縮、分段鹽析(圖3)后，酶的活力及純度得到了提高，酶提純加工過程中的各項性能指標如表2所示。

圖3 (NH4)2SO4飽和度對纖維素酶提取率的影響Fig.3 Effect of (NH4)2SO4saturation degree on the extraction rate of cellulase

圖3顯示，從SMC中提取的纖維素酶經(jīng)膜濃縮后的酶液在60%的(NH4)2SO4飽和度下鹽析沉淀的組分最高，沉淀的酶泥中總酶活力為88830U，回收率達到抽提酶液中總酶活力的65.54%。

表2表明，SMC浸提液通過濃縮和鹽析沉淀可以獲得65.54%纖維素酶回收率，樣品酶比活力達到20.95U/mg，純度比浸出液提高了2.53倍。此純度的酶制劑達到輕工業(yè)標準GB2583—2003《纖維素酶制劑》產(chǎn)品理化指標對酶活力標準的要求。

2.5 高純度纖維素酶雙水相萃取制備條件分析

2.5.1 雙水相組成對纖維素酶萃取性能的影響

由于雙水相萃取體系的組成性質(zhì)不同，酶進入雙水相體系后，由于表面性質(zhì)、電荷作用和各種力(如疏水鍵、氫鍵和離子鍵等)的存在和環(huán)境因素的影響，使其在上、下相中的質(zhì)量分數(shù)不同，實驗通過分別調(diào)整體系中PEG6000和(NH4)2SO4濃度，測定其對纖維素酶在兩相中的分配率的影響，結(jié)果如圖4、5所示。

圖4 雙水相組成中(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)對纖維素酶分配系數(shù)及回收率的影響Fig.4 Effect of (NH4)2SO4concentration in aqueous two-phase system on the partition coefficient and yield of cellulase

圖5 雙水相組成中PEG6000質(zhì)量分數(shù)對纖維素酶分配系數(shù)及回收率的影響Fig.5 Effect of PEG6000 concentration in aqueous two-phase system on the partition coefficient and yield of cellulase

由圖4可知，隨著(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)的增加，分配系數(shù)逐步下降，說明纖維素酶向下相(NH4)2SO4水相層分散，至(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)增加到22%時出現(xiàn)拐點，此時的纖維素酶最高回收率為78.95%；而圖5結(jié)果分析同樣發(fā)現(xiàn)當體系中的PEG6000質(zhì)量分數(shù)為20%時，k為0.24，纖維素酶最高回收率為79.35%。因此，合適纖維素酶萃取的PEG6000-(NH4)2SO4雙水相體系組成為PEG6000質(zhì)量分數(shù)20%，(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)22%。

2.5.2 雙水相萃取條件的優(yōu)化

在上述最適雙水相體系中添加NaCl考察在此雙水相體系中NaCl濃度對纖維素酶分配率的影響，結(jié)果見圖6。

表2 SMC纖維素酶粗酶的純化Table2 A summary of purification of industrial grade cellulase from crude enzyme solution

表3 高純度提取纖維素酶的純化結(jié)果Table3 A summary of purification of high-purity cellulase from crude enzyme solution

圖6 外加NaCl對纖維素酶在雙水相中分配系數(shù)及回收率的影響Fig.6 Effect of NaCl concentration in aqueous two-phase system on the partition coefficient and yield of cellulase

圖6顯示，在質(zhì)量分數(shù)22% PEG6000-質(zhì)量分數(shù)20% (NH4)2SO4形成的雙水相系統(tǒng)中調(diào)整NaCl的濃度(0～13mmol/L)對纖維素酶的分配性能有一定的影響，在NaCl濃度0～7mmol/L時k值稍有下降(7mmol/L時，k為0.228，酶的回收率可達到80.3%)，有利于酶在下相中分配，但隨著NaCl濃度的進一步增加分配系數(shù)會明顯上升，反而不利于酶在水相中的分配。這與一般認為外加中性鹽會改變系統(tǒng)的相圖和分配特性[10-11]相符合。

加7mmol/L NaCl后調(diào)整雙水相體系的pH值，pH值在4～7范圍內(nèi)分別考察纖維素酶的分配情況，結(jié)果如圖7所示。

圖7 pH值對纖維素酶在雙水相中分配系數(shù)及酶回收率的影響Fig.7 Effect of pH of aqueous two-phase system on the partition coefficient and yield of cellulase

圖7表明，PEG6000/(NH4)2SO4雙水相系統(tǒng)中pH值在4～7區(qū)間內(nèi)纖維素酶分配系數(shù)有小幅度波動，pH5.5時分配系數(shù)最低(0.217)，酶回收率最高(81.8%)。產(chǎn)生這種現(xiàn)象可解釋為系統(tǒng)pH值變化使酶所帶的表面凈電荷發(fā)生了改變， 一般真菌產(chǎn)纖維素酶的等電點為4.5～5.5[15]，當系統(tǒng)的pH值高于5.5時酶表面負電荷增加，分配在下相(NH4)2SO4溶液中的酶量會相應(yīng)減少。

2.6 纖維素酶的凝膠層析

PEG6000-(NH4)2SO4雙水相提取的纖維素酶再經(jīng)過Sephadex G-100凝膠層析，純化效果如圖8及表3所示。

圖8 纖維素酶復(fù)溶提純液Sephadex G-100層析洗脫曲線Fig.8 Elution curve of redissolved cellulose on Sephadex G-100 column

由圖8可見，高組分蛋白質(zhì)與高酶活力組分峰值明顯，兩峰的重疊性較好，整個洗脫過程中雜蛋白峰很少，說明上樣組分中纖維素酶蛋白質(zhì)純度較高，也證明共沉復(fù)溶雙水相法提純高純度纖維素酶具有高效性和可行性。

表3表明， PEG6000-(NH4)2SO4雙水相提純纖維素酶可以獲得53.66%酶回收率，樣品酶比活力達到98.37U/mg，純度比浸提液提高了11.86倍，而經(jīng)過Sephadex G-100凝膠層析之后的纖維素酶純化指標比活力為106.62U/mg，純度雖然比雙水相萃取法稍有提高，但纖維素酶總活力損失也因此增加了2.44%。實驗數(shù)據(jù)再次肯定了雙水相萃取法在提純纖維素酶蛋白具有較好的應(yīng)用效果。

3 結(jié) 論

本實驗利用生化分離手段從食用菌廢棄栽培塊中提取商品價值較高的纖維素酶，該方法較一般的發(fā)酵纖維素酶生產(chǎn)具有較大的成本優(yōu)勢，科學(xué)合理地利用了食用菌生產(chǎn)中的廢棄資源，提高了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的附加值，所提取的產(chǎn)品安全性能可靠，應(yīng)用領(lǐng)域比較廣泛。本研究在實驗條件下制備了酶活力2865.47U/mL的工業(yè)級纖維素酶制劑，酶總活力回收率達到65.54%；而運用雙水相萃取和凝膠層板技術(shù)得到了酶活力為10208.46U/mL、酶比活力為106.62U/mg的高純度酶樣品，酶回收率為51.22%，純度是浸提液的12.85倍，比常規(guī)鹽析-層析法提純周期明顯縮短，成本消耗也較低廉，過程容易放大，純化后的酶安全性良好。

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Extraction and Purification of Cellulase from Spent Mushroom Compost

DU Ning，XU Tian-tian，LI Xian-fu，XIA Zhi-hua，CHEN Jun*
(College of Life and Environment Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China)

Spent mushroom compost (SMC) was used to prepare industrial grade cellulase by solvent extraction, membrane filtration and salting out and high-purity cellulase by further aqueous two-phase extraction. The results showed that crude cellulase solution with an enzymatic activity of 102.64 U/mL was obtained after 3 h of extraction at 25 ℃ with an extraction solvent composed of 0.2 mol/L acetic-acetate sodium buffer at pH 5.0 and 0.2% Triton X-100. Subsequent salting out at 60% (NH4)2SO4 saturation could recover 65.54% of the total cellulase activity, and industrial grade cellulase with an enzymatic activity of 2865.47 U/mL was obtained. After further aqueous two-phase extraction with a system made up of 22% polyethylene glycol 6000 (PEG6000) and 20% (NH4)2SO4 under the conditions of 7 mmol/L NaCl, pH 5.5 and normal temperature, the cellulase activity and specific activity were 10208.46 U/mL and 106.62 U/mg, respectively and a total activity yield of 51.22% was achieve, revealing a 12.85-fold increase when compared with that of crude enzyme solution. As a result, high-purity cellulase was obtained.

spent mushroom compost(SMC)；cellulose；aqueous two-phase extraction；extraction and purification

TS209

A

1002-6630(2012)01-0125-06

2011-02-14

國家自然科學(xué)基金項目(50678102；0000005472)；上海市教委青年基金項目(03DQ25)；上海師范大學(xué)科技基金項目(SK201228)；上海市大學(xué)生科研創(chuàng)新活動計劃項目(CX016)

杜寧(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為微生物分子生物學(xué)。E-mail：Duing@shnu.edu.cn

*通信作者：陳軍(1966—)，男，副教授，博士，研究方向為微生物酶學(xué)。E-mail：cj7206@shnu.edu.cn