張文清，左萍萍，徐 辰，楊 蕾，張玉龍，夏 瑋

(華東理工大學化學與分子工程學院，上海市功能性材料化學重點實驗室，上海 200237)

海帶中巖藻多糖的分離純化與結(jié)構(gòu)分析

張文清，左萍萍，徐 辰，楊 蕾，張玉龍，夏 瑋*

(華東理工大學化學與分子工程學院，上海市功能性材料化學重點實驗室，上海 200237)

通過DEAE-纖維素和凝膠過濾色譜反復柱層析，采用苯酚-硫酸法和高效凝膠過濾色譜法(HPGFC)檢測，從提取的海帶巖藻多糖中得到了均一多糖TC-1，并結(jié)合多種分析手段：包括糖組成分析、甲基化分析、紅外光譜(IR)分析等對其化學結(jié)構(gòu)進行測定。結(jié)果表明：TC-1重均相對分子質(zhì)量(Mw)為3.7×105，主要由巖藻糖構(gòu)成，此外還伴有少量的木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成的結(jié)構(gòu)復雜的硫酸酯多糖。其中巖藻糖糖基以1,4-、1,3-連接方式存在；木糖以1,3-連接方式存在；甘露糖以1,3-、1,6-連接方式存在；葡萄糖以1,3,4-、1,2,4,6-連接方式存在；半乳糖以1,6-、1,3,6-、1,3,4,6-連接方式存在。

海帶；巖藻多糖；分離純化；結(jié)構(gòu)分析

海帶具有很高的食用、藥用價值。研究表明，海帶所含的巖藻多糖具有明顯的生理活性，如抗腫瘤、促進造血功能等[1-2]。隨著人們對巖藻多糖的深入研究，得知其并非單一結(jié)構(gòu)的化合物，其組成十分復雜，稱為含巖藻糖的硫酸多糖(fucose-containing sulfated polysaccharides)。由于巖藻多糖的含量和結(jié)構(gòu)受多種因素影響[3]，目前國內(nèi)外的報道對其結(jié)構(gòu)組成沒有統(tǒng)一的定義，大多是對其進行初步純化[4]，得到巖藻多糖的混合物。國外部分學者對巖藻多糖的結(jié)構(gòu)進行了研究[4-6]，但海帶的深度開發(fā)卻涉及較少。本研究利用我國資源豐富的海帶，綜合各種分離手段，得到均一多糖組分，并鑒定了它的一級結(jié)構(gòu)，旨在為今后巖藻多糖的開發(fā)利用提供技術資料和結(jié)構(gòu)信息。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海帶產(chǎn)自山東威海。

DEAE-纖維素 美國Whatman公司；Sephacryl S-300、S-200凝膠層析介質(zhì) 美國Pharmacia公司；標準葡聚糖 美國Fluka公司；透析袋(截留相對分子質(zhì)量1000) 上海綠鳥科技公司；纖維素板 上海市藥品檢驗所；單糖對照品 美國Sigma公司；無水二甲亞砜、無水硫酸鈉、碘甲烷 國藥集團化學試劑有限公司；三氯甲烷 上海化學試劑有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

TL-5.0臺式離心機 上海市離心機械研究所；BT-100恒流泵 上海市滬西分析儀器廠；TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；SBS-100數(shù)控計滴自動部分收集器 上海市青浦滬西儀器廠；玻璃層析柱 上海市亞榮生化儀器廠；R-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申科機械研究所；FD1冷凍干燥機 北京博醫(yī)康儀器有限公司；vario EL Ⅲ型元素分析儀 德國Sartorius Gmbh公司；Agilent1100高效液相色譜儀、Agilent 6890 5975氣質(zhì)聯(lián)用儀(色譜柱為HP-5型毛細管柱) 美國安捷倫有限公司；Nicolet Magna-IR550紅外光譜儀 美國Nicolet公司。

1.3 海帶中巖藻多糖的提取[7-8]

取潔凈干燥的海帶50g，粉碎后用無水乙醇浸泡，脫脂后的固體殘渣用水提取(料液比1:10(m/V)，60℃提取2h)，提取3次，合并提取液，離心，濃縮上清液至小體積，加入無水乙醇，至所含乙醇的體積分數(shù)為3 0%，過濾，上清液再加無水乙醇至其體積分數(shù)為60%，離心收集沉淀，真空干燥得巖藻多糖粗品。

將巖藻多糖配成5g/100mL的水溶液，用CaCl2對其進行初步純化。溶液中加入4mol/L CaCl2，離心后取上清液，加乙醇至其體積分數(shù)為65%，用乙醇和丙酮浸洗沉淀，40℃干燥得到巖藻多糖。

1.4 巖藻多糖的分離純化[9]

稱取2g巖藻多糖溶于20mL去離子水，經(jīng)DEAE-纖維素柱(1.5cm×50cm)初步分離。依次用去離子水和0.6、1.0、2.0mol/L NaCl溶液洗脫，洗脫流速為2mL/min，采用苯酚-硫酸法檢測多糖含量，以洗脫體積為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制洗脫曲線。將各部分洗脫液分別減壓濃縮至適當體積，對蒸餾水透析，透析袋內(nèi)液冷凍干燥得F-A、F-B、F-C、F-D。用Sephaeryl S-300凝膠層析柱(1.6cm×80cm)進一步分離F-C，同時用苯酚-硫酸法和高效凝膠過濾色譜法(HPGFC)進行檢測，最終得到均一多糖組分TC-1。

1.5 多糖純度及其相對分子質(zhì)量分布測定

采用高效液相凝膠過濾色譜法(HPGFC)。樣品及系列標準多糖(不同相對分子質(zhì)量的葡聚糖：Mw分別為11600、66700、123600、196300、500000)分別流經(jīng)Agilent1100高效液相色譜系統(tǒng)中TSKG 5000PWXL色譜柱，流動相為0.1mol/L NaNO3溶液，流速為0.5mL/min，示差折光檢測器檢測。由標準多糖的相對分子質(zhì)量對數(shù)與保留時間做標準曲線，根據(jù)標準曲線及Agilent GPC軟件計算樣品相對分子質(zhì)量及分布，樣品純度由峰型判斷。

1.6 單糖組成分析[10]

取多糖樣品2～3mg置于5mL安瓿瓶中，加2mol/L三氟乙酸(TFA)2mL，封管，120℃水解2h。旋蒸除盡溶液中的TFA，之后加入少量蒸餾水，取5μL進行薄層分析。用乙酸乙酯、吡啶、水、乙酸(體積比為5:5:3:1)的混合液展開劑展開后，苯胺-鄰苯二甲酸顯色，所得結(jié)果與標準單糖對照。水解產(chǎn)物另一部分，室溫下加入NaBH4，反應2h(間隙振蕩)，生成糖醇乙酰酯衍生物，進行GC-MS分析。以標準單糖的糖醇全乙?；苌?制備方法同多糖樣品，但勿需TFA水解)作對照。分析條件：Agilent 6890 5975 GC-MS；色譜柱型號：HP-5色譜柱(30m×0.25mm，0.25μm)；分流比20:1；進樣量0.2μL；采取程序升溫：初始溫度/停頓時間為150℃/2min；程序升溫終止溫度/停頓時間為220℃/10min；升溫速率5℃/min。

1.7 甲基化分析

根據(jù)Needs等[11]法對多糖樣品進行甲基化，IR檢測產(chǎn)物無羥基特征吸收峰，表明其甲基化完全。將完全甲基化的多糖樣品溶于90%甲酸水溶液，密塞，100℃水浴解聚6h，除盡甲酸后，加入2mol/L TFA，120℃密封水解2h后除去過量TFA。固體殘渣經(jīng)NaBH4還原、乙?；频貌糠旨谆陌柕洗家宜狨パ苌?，進行GC-MS分析。分析條件：Agilent 6890 5975 GC-MS；色譜柱型號：HP-5色譜柱(30m×0.25mm，0.25μm)；分流比3:1；進樣量1μL(氯仿為溶劑)；采取程序升溫：初始溫度/停頓時間為120℃/2min；程序升溫終止溫度/停頓時間250℃/10min；升溫速率5℃/min。

1.8 紅外光譜(IR)分析及元素分析

取1～2mg樣品，KBr研磨壓片后進行IR分析，甲基化后的樣品采用衰減全反射ATR附件測定IR吸收。采用IR吸收法、vario EL Ⅲ型元素分析儀檢測樣品是否含有硫酸根及硫酸根的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 TC-1的分離純化

圖1 巖藻多糖的DEAE-纖維素柱色譜分離Fig.1 Elution pattern of crude polysaccharides extracted from kelp on DEAE-cellulose column

如圖1所示，各部分洗脫液分別減壓濃縮至適當體積，用蒸餾水透析，透析袋內(nèi)液冷凍干燥所得產(chǎn)物，分別命名為F-A、F-B、F-C、F-D，4個組分多糖總量分別為35、610、690、18mg。

多糖的純度不能以通常小分子化合物的純度標準來衡量，因為多糖是一種生物高分子化合物，其存在微觀不均一性。多糖的純度代表是某一多糖的相似鏈長的平均分布。目前通常采用高效液相凝膠過濾色譜法(HPGFC)對多糖進行純度檢測。一般來說，在凝膠柱填料的排阻極限內(nèi)，HPGFC譜中呈現(xiàn)窄的單一對稱峰的多糖組分可被認為是均一多糖。檢測結(jié)果表明，F(xiàn)-A、F-B、F-C、F-D都不純，均需要進一步分離純化才能得到均一多糖。本實驗僅對F-C部分作進一步分離純化，色譜圖見圖2。

圖2 F-C的凝膠過濾色譜圖Fig.2 Gel filtration chromatogram of F-C

根據(jù)GPC軟件計算可知F-C部分可能含有兩種多糖組分，根據(jù)其相對分子質(zhì)量分布，選擇Sephacryl S-300作為凝膠層析介質(zhì)(1.6cm×80cm)進行純化。采用苯酚-硫酸法和HPGFC同時進行檢測，得到均一多糖TC-1，其色譜圖見圖3。以已知相對分子質(zhì)量的標準葡聚糖制作校正曲線，根據(jù)多糖樣品的保留時間，由GPC軟件計算出TC-1的重均相對分子質(zhì)量Mw為3.7×105，數(shù)均相對分子質(zhì)量Mn為3.0×105。

圖3 TC-1的凝膠過濾色譜圖Fig.3 Gel filtration chromatogram of TC-1

2.2 TC-1的紅外光譜分析

由圖4可知，3421cm-1處強吸收峰為O-H伸縮振動峰；2926cm-1為C-H的伸縮振動吸收峰；1645cm-1處為糖環(huán)的伸縮振動峰；1258cm-1附近處是由硫酸基S＝O伸縮振動引起的，證明了TC-1是含有硫酸基取代的多糖；1084cm-1處為C-O的伸縮振動峰；848cm-1為C-O-S(直立鍵)的伸縮振動峰，硫酸基連接在糖環(huán)的C4位上；此外在1720cm-1附近未檢測到吸收峰，說明不含有糖醛酸；在810cm-1及870cm-1處無吸收，說明可能不含甘露糖[12]。

圖4 TC-1的紅外光譜圖Fig.4 IR spectrum of TC-1

2.3 TC-1單糖組成分析

TC-1以2mol/L TFA 120℃水解后的產(chǎn)物進行纖維素薄層層析(TLC)，以標準單糖為對照，苯胺-鄰苯二甲酸噴霧顯色后顯示有巖藻糖(棕色斑點)﹑木糖(紅色斑點)、甘露糖(紅色斑點)、半乳糖(棕色斑點)和葡萄糖(棕色斑點)的存在，另外，在Rf值等同于標準半乳糖醛酸的位置處未發(fā)現(xiàn)紅棕色斑點，說明TC-1不含有半乳糖醛酸成分，與上述的紅外結(jié)果一致。

圖5 TC-1的總離子流圖Fig.5 GC-MS total ion current chromatogram of TC-1

為證實TLC的結(jié)果，另取TC-1用2mol/L TFA120℃水解2 h，經(jīng)硼氫化鈉還原，乙酸酐乙?；螅苌镞M行GC-MS分析，如圖5所示，通過與標準單糖相應衍生物的保留時間(圖6)比較，得知TC-1主要含有巖藻糖，伴有少量的木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其物質(zhì)的量比為17.3:1.0:2.6:3.8:5.1。通過IR測定，1240cm-1吸收峰是S＝O伸縮振動特征吸收峰，830cm-1是C-O-S振動的特征頻率[13]，元素分析法測得的硫酸基含量為22.4%，印證了巖藻多糖是含有相當數(shù)量的巖藻糖(fucose)和硫酸基的多糖[14]。

圖6 標準單糖衍生物的總離子流圖Fig.6 GC-MS total ion current chromatogram of mixed standard monosaccharides

2.4 TC-1的甲基化分析

TC-1完全甲基化產(chǎn)物經(jīng)90%甲酸解聚、TFA水解、硼氫化鈉還原及乙?；笾频貌糠旨谆陌柕洗家宜狨パ苌锖筮M行GC-MS分析，結(jié)果見表1。

表1 TC-1甲基化分析結(jié)果Table1 Methylation analysis of reduced TC-1

由表1可知，巖藻糖殘基存在1,4-、1,3-兩種連接方式，主要以1,3連接方式為主；木糖殘基以1,2-連接方式存在；甘露糖有1,3-、1,6-兩種連接方式；葡萄糖存在1,3,4-、1,2,4、6-兩種連接方式；半乳糖有1,6-、1,3,6-、1,3,4,6- 3種連接方式。

綜合以上的分析結(jié)果，TC-1為重均相對分子質(zhì)量為3.7×105，硫酸基含量為22.4%，由巖藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成的復雜硫酸酯多糖。其中巖藻糖糖基以1,4-、1,3-的連接方式存在；木糖以1,3-連接方式存在；甘露糖以1,3-、1,6-連接方式存在；葡萄糖以1,3,4-、1,2,4,6-連接方式存在；半乳糖以1,6-、1,3,6-、1,3,4,6-連接方式存在。

3 討 論

關于海帶中巖藻多糖的組成[15]國內(nèi)外已有報道。程忠玲[13]報道海帶中提取的褐藻糖膠為一種水溶性雜聚糖，其主要原始成分是L-巖藻糖-4-硫酸酯，以及少量的半乳糖、甘露糖、木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)和鉀、鈉、鈣、鎂等金屬離子。L-巖藻糖-4-硫酸酯的結(jié)構(gòu)特征是1,2-連接的聚α-L-吡喃巖藻糖。主鏈由巖藻糖組成，在巖藻糖上含有大量的硫酸基。李林等[16]研究發(fā)現(xiàn)海帶中的褐藻糖膠是由鼠李糖(Rha)、巖藻糖(Fvc)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glu)、葡萄糖醛酸、硫酸根及蛋白質(zhì)構(gòu)成的復合物，其中單糖的物質(zhì)的量比為Rha:Fuc: Xyl: Man: Gal: Glu=0.41:1.72:3.75:0.96:1:2.17。褐藻糖膠的葡萄糖醛酸、硫酸根及蛋白質(zhì)的含量分別為6.2%、8.7%和4.1%。與這些報道相比，本實驗從海帶中獲得的TC-1的單糖組成與它們有所不同，為其在生物活性多樣性方面[17]的研究應用提供了基礎。

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Isolation, Purification and Structural Analysis of Fucoidan from Kelp

ZHANG Wen-qing，ZUO Ping-ping，XU Chen，YANG Lei，ZHANG Yu-long，XIA Wei*
(Shanghai Key Laboratory of Functional Materials Chemistry, School of Chemistry and Molecular Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China)

A homogeneous polysaccharide named as TC-1 was obtained from kelp by DEAE-cellulose and gel filtration chromatography. Its chemical structure was characterized by means of monosaccharide composition analysis, methylation analysis and IR spectroscopic analysis. TC-1 was a complex sulfated polysaccharide with a weight-average molecular weight of 3.7 × 105. TC-1 mainly consisted of fucose and small amounts of xylose, mannose, glucose and galactose were also found. The chain of TC-1 included 1,4-linked or 1,3-linked fucose, 1,3-linked xylose, 1,3-linked or 1,6-linked mannose, 1,3,4-linked or 1,2, 4,6-linked glucose, and 1,6- linked,1,3,6- linked, or 1,3,4,6- linked galactose.

kelp；fucoidan；isolation and purification；structural analysis

O636.1

A

1002-6630(2012)01-0068-04

2011-01-14

張文清(1969—)，女，教授，博士，主要從事天然產(chǎn)物及功能材料的研究。E-mail：zhwqing@ecust.edu.cn

*通信作者：夏瑋(1976—)，女，副教授，博士，主要從事天然產(chǎn)物的研究與開發(fā)。E-mail：xiawei1999@ecust.edu.cn