樸香蘭，鄧長芹，陳虎彪，王 進(jìn)

(1. 中央民族大學(xué)中國少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究院，北京 100081；2. 香港浸會(huì)大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，香港)

快速分析彝藥桃樹寄生抗氧化成分

樸香蘭1，鄧長芹1，陳虎彪2，王 進(jìn)1

(1. 中央民族大學(xué)中國少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究院，北京 100081；2. 香港浸會(huì)大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，香港)

目的：快速分離、鑒定彝藥桃樹寄生的抗氧化成分。方法：通過1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 自由基清除實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)彝藥桃樹寄生的甲醇提取物及其二氯甲烷、正丁醇及水萃取物的抗氧化作用，利用生物活性-高效液相跟蹤方法，快速分離、鑒定其有效成分。結(jié)果：從彝藥桃樹寄生的二氯甲烷萃取物中分離、鑒定出有效成分為松脂酚(pinoresinol)。結(jié)論：利用生物活性-高效液相跟蹤方法可以快速分離、鑒定彝藥桃樹寄生中的抗氧化成分，可應(yīng)用于其他天然植物活性成分的快速篩選。

彝藥桃樹寄生；DPPH自由基清除作用；生物活性-高效液相跟蹤方法；松脂酚

隨著基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)的不斷發(fā)展，人們對自由基的研究越來越多，其中就有大量關(guān)于自由基與疾病的研究。自由基作為機(jī)體的正常代謝產(chǎn)物，在平衡狀態(tài)下，其在抗菌、消炎和抑制腫瘤等方面具有重要作用和意義；一旦平衡被打破，如機(jī)體受到疾病或某些外源性藥物和毒物的侵害，自由基便會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)大的傷害作用，造成生物膜的脂質(zhì)過氧化損傷，引起酶、氨基酸、蛋白質(zhì)的氧化破壞，對內(nèi)臟器官、免疫系統(tǒng)的形態(tài)功能產(chǎn)生影響，從而引起機(jī)體疾病，甚至死亡[1]。

近年來，天然植物倍受推崇，如何首烏、黃芪、人參、紅景天等，我國少數(shù)民族地區(qū)的天然植物的應(yīng)用亦表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景[2-5]。通過前期對部分少數(shù)民族常用植物的篩選，發(fā)現(xiàn)彝藥桃樹寄生具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

彝藥桃樹寄生為桑寄生科(Loranthaceae)鈍果寄生屬(Taχillus)的柳葉鈍果寄生(Taχillus delavayi (Van Tiegh.) Danser)的寄生全株，又名柳樹寄生，主產(chǎn)于云南、四川、貴州、廣西、廣東、湖南、江西、福建、臺(tái)灣，為薔薇科植物桃樹上寄生的寄生全株。性溫、味澀，具有溫經(jīng)活血、調(diào)經(jīng)暖宮之功效。彝醫(yī)藥書《聶蘇諾期》就有收載桃樹寄生[6]，彝醫(yī)用于治療不孕癥、婦科附件炎等。而桑寄生科在《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品，有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕、安胎元功能?！吨袊幍洹?005年版收載的桑寄生為桑寄生科植物桑寄生(Taχillus chinensis (DC.)Danser)的干燥帶葉莖枝，用于風(fēng)濕痹痛、腰膝酸軟、筋骨無力、崩漏經(jīng)多、妊娠漏血、胎動(dòng)不安、高血壓等[7]。彝藥桃樹寄生與中藥桑寄生是同一科同一屬而不同種植物，它們的功能主治也有所不同。桑寄生的物質(zhì)基礎(chǔ)及其生物活性研究有些報(bào)道[8-11]，然而，彝藥桃樹寄生的有效成分的研究報(bào)道較少，因此本研究選擇彝藥桃樹寄生進(jìn)行抗氧化有效成分的分析。

然而，天然產(chǎn)物中成分多而復(fù)雜，用傳統(tǒng)的分離方法，不但需要很多時(shí)間，而且浪費(fèi)不必要的溶劑及勞動(dòng)力。本研究采用生物活性-高效液相色譜跟蹤(bioassay-linked HPLC)方法，快速分離、鑒定桃樹寄生中的抗氧化成分，以期為天然植物的開發(fā)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

彝藥桃樹寄生采集于云南省昆明市祿勸縣烏蒙鄉(xiāng)，經(jīng)香港浸會(huì)大學(xué)陳虎彪教授鑒定為桑寄生科鈍果寄生屬的柳葉鈍果寄生。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 日本W(wǎng)ako Pure Chemical Industries公司；硅膠 青島海洋化工廠分廠；所有化學(xué)試劑均為分析純 北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

DPBRUKER DPX 300核磁共振儀 瑞士Bruker公司；Agilent 1100 Series LC/MSD Trap (VL) 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司；Waters 600色譜儀高效液相色譜儀(配Waters2996檢測器) 美國Waters公司；YMC柱(RP-18，250mm × 4.6mm，5μm) 日本YMC公司； Benchmark Plus 酶標(biāo)儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 彝藥桃樹寄生有效成分的提取、分離

彝藥桃樹寄生5.0kg，用10、8、8倍量的80% 甲醇加熱回流提取3次，每次3h，合并3次提取液，減壓濃縮，真空干燥，得甲醇提取干膏(301.8g)。甲醇提取物用水混懸，依次用二氯甲烷(3次)、正丁醇(3次)萃取。分別得到二氯甲烷(TDD)、正丁醇(TDB)和水萃取物(TDW)11.3、224.6、48.0g，并對各部位進(jìn)行DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)

參照參考文獻(xiàn)[12]稍加修改。用乙醇溶解的不同質(zhì)量濃度的樣品100μL與60μmol/L DPPH溶液100μL，加入96孔板中，混勻后，室溫避光放置30min，然后在波長517nm處測OD值，測定DPPH自由基清除率，與不加樣品的對照組進(jìn)行DPPH自由基清除效果的比較，然后用半數(shù)有效值IC50(抑制50%的DPPH自由基生成所需樣品的質(zhì)量濃度)表示抗氧化活性。DPPH自由基清除率的計(jì)算公式如式(1)。

式中：OD空為加DPPH的空白溶液孵育后的OD值；OD空0為空白溶液孵育前的OD值；OD樣為加DPPH的樣品溶液孵育后的OD值；OD樣0為樣品溶液孵育前的O D值。

1.3.3 TDD部位有效成分的分離

桃樹寄生的二氯甲烷萃取物(TDD)上樣于硅膠柱，用乙酸乙酯、石油醚作為洗脫液，以1:100、1:50、1:30、1:15、1:10、1:1和100%乙酸乙酯順序洗脫。對流出液進(jìn)行硅膠板點(diǎn)樣與展開，根據(jù)Rf值將TDD分成10個(gè)組分(TDD1～TDD10)，并對各組分進(jìn)行DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)，比較它們的抗氧化活性。

對抗氧化活性較強(qiáng)的TDD8進(jìn)行生物活性-高效液相跟蹤，鑒定有效成分。TDD8用甲醇配成2mg/mL的溶液，進(jìn)樣20μL于高效液相分析柱(YMC柱)。高效液相使用水和甲醇作為溶劑系統(tǒng)，以甲醇50%(0min)～甲醇100%(30min)洗脫，流速為1mL/min，流出液以300μL/孔的速度接樣于96孔板，并放在通風(fēng)廚中揮發(fā)溶劑。溶劑揮發(fā)后的96孔板用于DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)，在9.8min處出現(xiàn)的峰顯示較高的DPPH自由基清除活性，并用半制備分析柱(YMC柱)進(jìn)行分離、純化有效成分TDD8-2。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

2 結(jié)果與分析

2.1 桃樹寄生DPPH自由基清除活性

對桃樹寄生的甲醇提取物及其TDD、TDB和TDW進(jìn)行DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明各部位樣品均顯示濃度依賴性的抗氧化活性，TDD對DPPH的半數(shù)抑制率IC50達(dá)到(74.50 ± 1.24 )μg/mL，尤其是TDB抗氧化效果最強(qiáng)，其IC50值為(22.21 ± 2.05)μg/mL(圖1)。

圖1 桃樹寄生的DPPH自由基清除活性Fig.1 DPPH radical scavenging activity of the methanol extract and its different solvent fractions

2.2 TDD部位有效成分的分離、鑒定

為了系統(tǒng)地進(jìn)行桃樹寄生的抗氧化有效成分的研究，首先從非極性的TDD著手進(jìn)行抗氧化有效成分的分析，然后陸續(xù)對桃樹寄生的正丁醇及水萃取物進(jìn)行有效成分的分離、鑒定。桃樹寄生的TDD經(jīng)硅膠柱分離，得到10個(gè)組分(TDD1～TDD10)，通過DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)對上面的10個(gè)組分及TDD總樣進(jìn)行分析，結(jié)果表明，除TDD1和TDD2以外，其他組分均有質(zhì)量濃度依賴性清除DPPH自由基清除活性，尤其是TDD8和TDD10顯示較強(qiáng)的抗氧化活性，而且TDD8組分的量相對較多，在質(zhì)量濃度50μg/mL時(shí)就對DPPH自由基清除率超過60% (圖2)。

圖3 桃樹寄生二氯甲烷萃取物活性組分的高效液相色譜(A)-抗氧化活性(B)圖Fig.3 HPLC separation peaks and antioxidant activity peaks of TDD8

圖2 桃樹寄生的二氯甲烷萃取物各組分DPPH自由基清除活性Fig.2 DPPH radical scavenging activity of different components of the dichloromethane-soluble fraction

圖4 化合物TDD8-2的氫譜Fig.4 1H-NMR spectrum of compound TDD8-2

圖5 化合物TDD8-2的碳譜Fig.5 13C-NMR spectrum of compound TDD8-2

為了分離、鑒定活性較強(qiáng)的TDD8中的有效成分，利用生物活性-高效液相跟蹤方法，快速確定TDD8中的有效峰。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以甲醇50%(0min)～甲醇100%(30min)洗脫，流速為1mL/min的條件下，在9.8min處出現(xiàn)的峰顯示較高的DPPH自由基清除活性。因此，采用半制備分析柱，使用甲醇和水的溶劑系統(tǒng)，選擇甲醇50%等度洗脫，有選擇地針對有效成分的峰進(jìn)行分離、純化，得到有效成分TDD8-2單體化合物(圖3)。

化合物TDD8-2為白色油狀物，分子式C20H22O6。有效成分TDD8-2在ESI-MS顯示準(zhǔn)分子離子峰m/z 381 [M＋Na]＋，357 [M-H]＋，1H-NMR (300MHz, CD3OD)δ：6.92 (2H, d, J＝1.25, H-2,2＇), 6.78 (2H, bdd, J＝8.2,1.6Hz, H-6,6＇), 6.75 (2H,bdd, J＝8.2,1.7Hz, H-5,5＇), 4.67 (2H, b, J＝4.5Hz, H-7,7＇), 4.19 (2H, m, Hb-9), 3.82 (3H, s, OCH3), 3.79 (2H, m, Ha-9), 3.09 (2H, m, H-8,8＇)(圖4)。13C-NMR (75MHz, CD3OD) δ：149.1(C-3,3＇), 147.3 (C-4,4＇), 133.8 (C-1,1＇), 120.0 (C-6,6＇), 116.1 (C-5,5＇), 111.0 (C-2,2＇), 87.4 (C-7,7＇), 72.6 (C-9,9＇), 56.4 (OCH3), 55.3 (C-8,8＇)(圖5)。結(jié)合文獻(xiàn)[13]確定抗氧化成分TDD8-2為松脂酚(pinoresinol)(圖6)。

圖6 桃樹寄生抗氧化成分的結(jié)構(gòu)式Fig.6 Chemical structure of compound TDD8-2

2.3 桃樹寄生有效成分的抗氧化活性

利用DPPH自由基清除活性檢測方法，以VC作為陽性對照，比較桃樹寄生中分離的有效成分松脂酚對DPPH自由基清除作用，結(jié)果表明它們均有質(zhì)量濃度依賴性清除DPPH自由基作用，松脂酚對DPPH自由基的IC50為(30.95 ± 1.75)μmol/L，接近VC的IC50值(23.24 ± 1.09)μmol/L。

3 結(jié) 論

桃樹寄生的甲醇提取物及其二氯甲烷、正丁醇和水萃取物都具有較強(qiáng)的抗氧化活性。針對量較多的桃樹寄生的二氯甲烷萃取物進(jìn)行組分分離，并對活性較強(qiáng)的組分進(jìn)行生物活性-高效液相跟蹤，快速分離、鑒定桃樹寄生的有效成分，通過ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR光譜數(shù)據(jù)，與相關(guān)文獻(xiàn)對照，抗氧化有效成分被鑒定為松脂酚。與陽性對照組VC比較，松脂酚顯示較強(qiáng)的DPPH自由基清除活性，其IC50為(30.95 ± 1.75) μmol/L，接近VC的IC50(23.24 ± 1.09)μmol/L。利用生物活性-高效液相跟蹤方法，可以快速分離、鑒定天然植物中的抗氧化成分，可應(yīng)用于食品中抗氧化有效成分的快速分析。

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Rapid Analysis of Antioxidant Constituents from Taχillus delavayi, a Yi Ethnomedicinal Material

PIAO Xiang-lan1， DENG Zhang-qin1，CHEN Hu-biao2，WANG Jin1
(1. Institute of Chinese Minority Traditional Medicine, Minzu University of China, Beijing 100081, China；2. School of Chinese Medicine, Hong Kong Baptist University, Hongkong, China)

Objectives: To rapidly separate and identify antioxidant constituents from the whole plant of Taχillus delavayi, a Yi ethnomedicinal material, and assess their antioxidant activity. Methods: The antioxidant activity of the methanol extract of the medicinal material and its different solvent fractions obtained by repeated extractions sequentially with dichloromethane, n-butanol and water was assessed by DPPH free radical scavenging assay. The dichloromethane-soluble fraction was further separated by silica gel column chromatography, and a high antioxidant component named as TDD8 was obtained and analyzed by bioassay-linked HPLC and1H-NMR. Results: An individual compound named as TDD8-2 was separated from TDD8 by semipreparative HPLC and identified by1H-NMR as pinoresinol. Conclusion: The bioassay-linked HPLC method allows the rapid separation and identification of antioxidant components from medicinal materials.

Taχillus delavayi；DPPH radical scavenging activity；bioassay-linked HPLC method；pinoresinol

R282.71

A

1002-6630(2012)01-0016-04

2011-02-14

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30973960；81011140347)；國家民委科研項(xiàng)目(09ZY17)；國家大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目(NMOE)(200911003)

樸香蘭(1965—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)樘烊凰幬锘瘜W(xué)。E-mail：xlpiao@163.com