段 瑩 張靈枝

(華南農業(yè)大學茶業(yè)茶學系 廣州 510642)

固定化酶是用物理或化學方法處理水溶性的酶使之變成不溶于水或固定于固相載體的但仍具有酶活性的酶衍生物［1］。作為酶學研究的新領域，固定化酶因其顯著的優(yōu)點越來越受到重視，通過將這項生物技術與茶葉生產相結合，有利于充分發(fā)揮茶葉內含酶在茶葉生產與深加工方面的重要作用，改善茶葉品質，拓展茶葉的深加工領域和應用范圍。

1 固定化酶技術的發(fā)展

固定化酶現(xiàn)象最早在1916年被 Nelson和Griffin發(fā)現(xiàn)，而直到1969年千煙一郎博士將其應用于工業(yè)，固定化酶才得以迅猛發(fā)展［2，3］。得益于固定化酶的穩(wěn)定性高、易于控制、回收方便、可反復使用、成本低廉等優(yōu)點，酶的固定化技術已經成為酶應用領域中的一個重要研究方向，推動生物酶得到廣泛而有效的利用，并開始在食品行業(yè)、生物工業(yè)、醫(yī)學診斷與藥品研究、環(huán)境保護、能源開發(fā)以及基礎研究等方面發(fā)揮重要作用［4］。

傳統(tǒng)的酶固定化方法大致可分為4類:吸附法［5］、交聯(lián)法［6］、包埋法［7］、共價結合法［8］。以上四種固定化酶方法各有其優(yōu)缺點。隨著生物技術的交叉發(fā)展，單一傳統(tǒng)固定化方法暴露的缺點已明顯限制了固定化酶技術的應用。因此在實際應用中，定向固定化酶技術以及多酶共固開始使用，嘗試多種方法交叉使用，以提高固定化酶的活力，取長補短。Zuzana等［9］通過使用高碘酸鈉活化半乳糖氧化酶糖鏈實現(xiàn)了對半乳糖氧化酶的定向固定，改善了催化動力學參數(shù)。蘇二正等人［10］比較了海藻酸鈉和殼聚糖兩種載體及不同固定化方法對單寧酶和β-葡萄糖苷酶的共固定化效果，結果表明以海藻酸鈉為載體，采用交聯(lián)-包埋-交聯(lián)固定化方法的效果最佳。

隨著技術的進步，以降低成本，提高酶活性和穩(wěn)定性，盡量減少或避免酶活力的損失為前提，新型載體酶固定化與無載體酶固定化技術開始受到廣泛關注，并開展了大量研究。Kong等［11］以由海洋細菌Zoogloeasp.產生的細胞結合多糖(CBP)凝膠珠為載體固定葡糖淀粉酶。Serrano等［12］研究一類新型的無載體酶固定化技術——交聯(lián)酶聚集體(CLEA)，將其用于氨基酰化酶的固定化，預期會顯著提高酶活回收率，降低成本。

2 固定化酶技術在茶葉方面的研究

固定化酶技術在茶葉方面的應用起步較晚，始于20世紀60年代，最早應用于解決紅茶“冷后渾”的問題。一項英國專利使用硅藻土固定單寧酶可以有效處理紅茶“冷后渾”的問題［13－15］。而日本則是將單寧酶固定在聚砜中空纖維超濾膜上以此獲得澄凈的茶湯［16］。

其后的研究主要集中在茶葉重要酶類的固定化方面，包括多酚氧化酶、β-葡萄糖苷酶、過氧化物酶、單寧酶、果膠酶等。通過對茶葉重要酶類酶固定化方法的研究與探討，尋求固定化技術的最優(yōu)條件和最佳組合，從而實現(xiàn)酶的最大利用率，在茶葉深加工方向和檢測領域發(fā)揮重要作用。

3 定化酶技術在茶葉方面的應用

3.1 茶飲料改進

速溶茶和茶飲料因其方便快捷的優(yōu)點，在近幾年內飛速發(fā)展并成為茶葉深加工的重要方向。但其冷溶性差、香氣淡薄、易產生混濁、風味保存期短等問題一直難以得到有效解決，嚴重阻礙了茶飲料行業(yè)的發(fā)展。

針對這些問題，前人開展了廣泛研究，發(fā)現(xiàn)單寧酶可以提高轉溶率，去除混濁現(xiàn)象;果膠酶能提高萃取率，改善茶湯的清澈度。此外，纖維素酶、過氧化氫酶、葡萄糖氧化酶、多酚氧化酶及過氧化物酶等對茶飲料品質也具有良好的改善作用。

呂連梅［17］研究發(fā)現(xiàn)，在茶飲料生產中添加固定化酶能有效改善茶飲料包括香氣在內的品質，茶湯添加果膠酶的處理有效的改善了茶湯的感官風味:香氣較高，滋味醇和。此外，經檢測發(fā)現(xiàn)，果膠含量、茶湯的pH值降低，有可能延長保存期。

李平等［18］將固定化β-葡萄糖苷酶應用于茶飲料的增香，經氣相色譜-質譜聯(lián)用儀分析后發(fā)現(xiàn)香氣的種類和總量均有所增加。蘇二正［19］將單寧酶與β-葡萄糖苷酶共固定化應用于茶飲料的除混研究，試驗顯示，經共固定化酶處理后茶飲料中的酯型兒茶素有所降解，茶飲料的濁度非常穩(wěn)定，茶乳酪的形成減少。

3.2 茶葉天然產物的生產

3.2.1 茶黃素生產 現(xiàn)代研究已經表明茶黃素具有抗癌、抗菌、抗病毒、抗心腦血管疾病等多種功效且效果明顯優(yōu)于茶多酚，被廣泛認定為茶葉生化成分利用潛力最大的物質之一。但是，從紅茶中提取得率低、分離純化困難、成本高，難于實現(xiàn)工廠化生產。因此，獲取高含量的茶黃素已成為茶學、食品和醫(yī)藥研究的重要課題。

屠幼英等［20］探討了固定化多酚氧化酶酶膜催化兒茶素生產茶黃素的最佳反應條件，并確定了酶膜法生產高純度茶黃素的5個重要因素及最佳組合，試驗獲得茶黃素含量75.0%以上的高純度茶黃素產品。

丁兆堂［21］用納米碳酸鈣固定多酚氧化酶，對茶多酚進行體外氧化制備茶黃素，結果表明，此法提取物含量較高、活性良好，具有工藝簡單、易于分離等優(yōu)點。陳曉敏［22］通過對比海藻酸鈉和殼聚糖2種固定化材料，確定固定化酶的最佳參數(shù)為酶液與海藻酸鈉比率1∶1、戊二醛濃度0.25%、cac12濃度2.0%，在pH在2.2～5.6的范圍內茶黃素穩(wěn)定性較高。

3.2.2 茶氨酸生產 Varuzhan H.Abelian等將Pseudomonas nitroreducens進行固定化，利用微生物酶連續(xù)將谷氨酰胺和乙胺轉化成茶氨酸，并認為溫度、pH、底物流速是影響茶氨酸合成效率的關鍵因素。

一項南京工業(yè)大學專利利用介孔TiO2材料多孔的獨特結構，固定化γ-谷氨酰轉肽酶為催化劑(MTOW-GGT)，一步法合成L-茶氨酸。其固定化酶是常規(guī)有機載體Eupergit C擔載量的30倍。

3.3 農殘檢測測定

酶抑制法作為農藥殘留快速檢測的重要手段，其檢測用酶最為關鍵。植物酯酶因其來源廣泛、價格低廉，成為酶抑制劑法測定農藥殘留的主要來源。但是其保存條件非?？量?，一般要保存在－20℃，在0℃左右大部分已失活，使用受到一定的限制;通過酶固定化后可以有效改善不易保存的弊端，對農藥的抑制效果也更加靈敏，便于保存與操作［23］。

許娟等［24］進行了硝酸纖維素膜(NC)固定植物酯酶的研究，建立了NC膜固定化植物酯酶的方法。與游離酶檢測進行對比，固定化酶對所測農藥敏感性都較高，更適合于農藥的快速檢測。此外，一項農藥殘留快速測定的國際專利將乙酰膽堿酯固定在一種特殊的、不與其活性部位發(fā)生反應的載體上面，既提高酶的穩(wěn)定性，又排除雜質對酶活性的影響，提高靈敏度100倍以上，方便儲存和保藏［25］。

3.4 酶傳感器

酶生物傳感器是由固定化的生物敏感膜和與之密切結合的換能系統(tǒng)組成，它把固化酶和電化學傳感器結合在一起，兼具了固定化酶專一性、高選擇性以及電化學高靈敏度的優(yōu)點。在生物傳感器領域中占有非常重要的地位?，F(xiàn)階段，通過酶固定化技術將酶膜與電、光、熱等敏感的元件組成酶傳感器用于茶葉內含成分的檢測已有較多研究。

Chindilous［26］研究了茶葉中酚類物質定量的酶膜傳感器制作方法，并將連接光導纖維的柱型酶傳感器用于茶葉黃烷醇類的定量。日本學者堀江秀樹［27］在氧電極頂部透氧性聚匹氟乙烯膜表面用丙烯樹脂網(wǎng)固定L-氨基酸氧化酶，制成酶傳感器，測定茶葉浸出液中的氨基酸濃度。此法對于高檔茶葉中含量較多的茶氨酸和精氨酸響應較強，適合在茶葉品質評定上應用。

5 小結

酶具有反應條件溫和，專一性強、反應效率高等特點，在茶葉深加工中有很大的應用。但是，目前的研究表明，通過酶的利用并沒有徹底解決茶加工中存在的問題，如香氣喪失、渾濁沉淀等。同時，酶本身在催化過程中易喪失，回收率很低，生產成本大。這些都阻礙了茶葉研究中酶的有效利用。

隨著現(xiàn)代生物技術的發(fā)展以及酶工程自身的完善，酶工程與茶葉深加工結合得更加緊密。固定化酶技術作為酶學研究的新領域，其顯著的應用優(yōu)勢在茶葉的深加工方向及應用領域發(fā)揮著重要作用。在茶葉生產中運用固定化酶技術對傳統(tǒng)制茶工藝進行改善，可以有效解決茶葉深加工中提取率不高、茶湯易混濁等問題，提升提取效率，增加生產效益。在解決茶葉品質問題、開發(fā)茶葉新產品方面達到事半功倍的效果。

但在目前的固定化酶應用中，依然存在酶活不高，操作半衰期不夠長，成本過高，不符合大工業(yè)生產的要求等問題。有理由相信，隨著對酶學研究的深入，酶固定化研究將會取得新的進展和突破。固定化技術為酶的研究和應用提供了廣闊的前景，同時，也為茶葉行業(yè)開辟了新的發(fā)展空間，注入新的活力［28］。

1 張樹政.酶制劑工業(yè)［M］.科學出版社，1998，349.

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17 呂連梅.固定化酶技術改善綠茶飲料香氣品質的研究［D］.浙江大學，2004

18 李平等.絲素蛋白膜固定β-葡萄糖苷酶及其改良食品風味的研究.菌物學報，2004，23(1):73 －78.

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20 屠幼英，方青，梁惠玲，黃海濤.固定化酶膜催化茶多酚形成茶黃素反應條件優(yōu)選.茶葉科學，2004，(2).

21 丁兆堂.綠茶多酚納米碳酸鈣固定化酶定向轉化及其產物的生物學活性研究［D］.山東農業(yè)大學，2005.

22 陳曉敏.茶黃素固定化酶生物合成及其穩(wěn)定性研究［D］.浙江大學，2007.

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26 Chindilis AL.Biosensors ＆ Bioelectrinics，1991，7:127.

27 堀江秀樹，鐘思強.用酶傳感器測定茶葉浸出液中的氨基酸濃度.中國茶葉加工，1993(3):42－44.

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