王獻慧，魏林，梁志懷，陳玉榮，張屹

（1.中南大學研究生院隆平分院，湖南長沙，410125；2.湖南省植物保護研究所；3.湖南省西瓜甜瓜研究所）

鐮刀菌屬遺傳多樣性的ISSR分析

王獻慧1，2，魏林2，梁志懷3，陳玉榮2，張屹1，2

（1.中南大學研究生院隆平分院，湖南長沙，410125；2.湖南省植物保護研究所；3.湖南省西瓜甜瓜研究所）

對運用分子生物學手段研究鐮刀菌屬的遺傳多樣性進展進行了綜述，并對ISSR分子標記技術在鐮刀菌屬遺傳多樣性方面的應用前景作出了分析與展望。

鐮刀菌；ISSR；遺傳多樣性

鐮刀菌屬 （Fusarium）是一類世界性分布的真菌，屬于兼寄生或腐生真菌。鐮刀菌能夠在土壤中越冬越夏，并能侵染多種植物，導致植物產(chǎn)生花腐、莖腐、莖基腐、根腐等多種病害，這種致病菌的寄主植物有100多種，能引起黃瓜枯萎病、菠菜枯萎病、豇豆枯萎病、茄子根腐病、辣椒枯萎病及蓮藕腐敗病等，侵染寄主植物的維管束系統(tǒng)，并產(chǎn)生毒素為害作物，使作物萎蔫死亡，嚴重影響多種作物的質(zhì)量和產(chǎn)量，引起嚴重的經(jīng)濟損失；部分鐮刀菌菌株能寄生在昆蟲、真菌、線蟲上，作為生防菌被利用[1，2]；部分鐮刀菌能夠產(chǎn)生真菌毒素，人畜食用了含該致病菌的作物之后，會出現(xiàn)食物中毒，嚴重的甚至死亡；部分鐮刀菌菌株能夠侵染人和動物，引起嚴重的疾病，還能夠分解纖維素，從而對整個地球生物圈的物質(zhì)循環(huán)起到一定的作用。鐮刀菌屬對人類影響如此之大，因此近200 a來，許多科學家對鐮刀菌屬的分類學進行了大量研究[3]。但由于鐮刀菌形態(tài)變異較大，給鐮刀菌的分類造成了一定的困難，使鐮刀菌的分類成為了一大難題。鐮刀菌分類學研究是鐮刀菌生物學各個領域研究的基礎，因此對鐮刀菌分類學的研究具有重要意義。

1 鐮刀菌屬遺傳多樣性研究進展

鐮刀菌屬是真菌中最難鑒定和最具價值的屬之一。自Wollenweber和Reinking于1935年提出該屬的分類系統(tǒng)以來，隨后在此基礎上陸續(xù)出現(xiàn)了10余種主要以形態(tài)學為依據(jù)的分類系統(tǒng)[4]。目前被人們廣泛應用的有兩大分類系統(tǒng)，其中一個是Burgess等[5]和Nelson等[6]提出的澳大利亞—美國—南非分類系統(tǒng)，另一個是歐洲分類系統(tǒng)[4]。我國最早進行系統(tǒng)的鐮刀菌屬分類學研究的科學工作者是俞大紱[7]，在30多年時間里，他做了大量的鐮刀菌屬分類學研究工作，終于在1955年正式發(fā)表了《中國鐮刀菌屬（Fusarium）菌種的初步名錄》，為之后學者們的研究工作奠定了基礎。1958年，王云章等翻譯了《鐮刀菌》，推動了我國鐮刀菌的研究工作的開展[3]。隨后陳鴻逵等[8]采用Booth的分類系統(tǒng)，對鐮刀菌進行了11 a的分類研究，發(fā)表了《浙江鐮刀菌志》。1989年之前，國內(nèi)外學者開展的鐮刀菌分類學研究工作均以形態(tài)學為基礎，鐮刀菌屬在形態(tài)學上的分類特征主要有厚垣孢子的有無及其產(chǎn)生方式；大、小型分生孢子的形態(tài)及其產(chǎn)生方式；產(chǎn)孢細胞的類型；分生孢子以及氣生菌絲的著生方式等。由于其分類的一些性狀不穩(wěn)定，給實際鑒定帶來許多困難；同時以形態(tài)學為基礎建立的分類系統(tǒng)也難以準確反映其系統(tǒng)發(fā)育關系。

以分子生物學為基礎建立的 Phylogenetic species能彌補以形態(tài)學為基礎的分類系統(tǒng)的一些不足，可科學地反映鐮刀菌的系統(tǒng)發(fā)育[9~12]。1989年Guadet等[13]首次應用分子生物學方法鑒定鐮刀菌屬種，隨后O'Donnell等[14]也采用了分子生物學方法對鐮刀菌屬的分類學進行了大量的研究。20多年來，學者們采用分子生物學方法對該屬的分類學做了大量研究工作，并澄清了鐮刀菌屬很多種間、種內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育關系、有性型-無性型的聯(lián)系。當前用于鐮刀菌屬分類學研究的分子生物學技術主要有RFLP、PAPD和AFLP[15，16]。在真菌分類學應用方面，SSR分子標記技術目前還未得到廣泛采用，而RFLP、RAPD、AFLP和SSR等分子標記技術在研究致病菌種DNA遺傳物質(zhì)差異性方面難度均比較大，只有ISSR技術在研究鐮刀菌屬的種間遺傳差異，特別是種內(nèi)生理小種的分化方面具有優(yōu)越性[17]。

2 ISSR分子標記技術應用于鐮刀菌屬遺傳多樣性分析

ISSR（inter-simple sequence repeat）是Zietkiewicz等[17]在1994年提出的一種微衛(wèi)星基礎上的分子標記。ISSR分子標記技術的基本原理是，以錨定的微衛(wèi)星DNA為引物，即在SSR序列的5'或3'端加上2～4個隨機核苷酸，在PCR反應中，錨定引物可引起特定位點退火，導致與錨定引物互補的間隔不大的重復序列間DNA片段進行PCR擴增。所擴增的inter SSR區(qū)域的多個條帶通過聚丙烯酰胺凝膠電泳得以區(qū)分，然后依據(jù)電泳條帶的有無以及相對位置來分析不同DNA樣本間ISSR分子標記的多態(tài)性。與SSR相比，ISSR引物可以在不同物種間通用，不像SSR引物具有較強的特異性。與RAPD和RFLP相比，ISSR揭示的多態(tài)性較高，精確度也較高。因此該技術是一種非常有發(fā)展前途的分子標記。目前該分子標記技術已經(jīng)被廣泛應用于作物的遺傳多樣性分析中。

李蕊倩等[18]應用ISSR技術辨別了全部供試的27株鐮刀菌，研究發(fā)現(xiàn)ISSR分子標記技術能夠使鐮刀菌種間和種內(nèi)均表現(xiàn)出很明顯的遺傳多樣性，因此認為ISSR分子標記技術可以用于分析研究鐮刀菌種間和種內(nèi)遺傳多樣性。其研究還發(fā)現(xiàn)采用ISSR技術對27個鐮刀菌菌株所分的種類與按傳統(tǒng)的形態(tài)分類學方法所分的種類基本上是一致的，但是也有一些鐮刀菌菌株所分種類與傳統(tǒng)的形態(tài)學分類方法所分的不一樣。他們認為在傳統(tǒng)形態(tài)分類學上相同的種，其種內(nèi)的個體之間存在比較大的DNA分子水平上的差異。因此，在傳統(tǒng)的形態(tài)分類學的基礎上，利用DNA分子水平上的遺傳學證據(jù)建立新的分類系統(tǒng)有待今后進一步研究。王建明等[19]為了確定鐮刀菌屬美麗組（Section Elegans）中尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）和芬芳鐮刀菌（F.redolens）2種菌的遺傳差異性和親緣關系，利用ISSR分子標記技術對這2種菌的35個菌株進行了遺傳多樣性分析。他們發(fā)現(xiàn)對全部供試的 35個菌株進行ISSR-PCR擴增均可取得很好的效果，說明鐮刀菌DNA基因組的SSR區(qū)域的遺傳差異性明顯、多態(tài)性高，表明ISSR分子標記技術用于分析鐮刀菌種間和種內(nèi)遺傳差異十分有效。

段會軍等[20]利用ISSR分子標記技術對50個西瓜枯萎病菌株進行了遺傳多樣性分析，他們發(fā)現(xiàn)ISSR分子標記技術能揭示西瓜枯萎病病菌的遺傳背景，并對全部供試的50個菌株進行了ISSR-PCR擴增，均可取得很好的效果，說明ISSR分子標記技術用于分析西瓜枯萎病菌生理小種的遺傳差異是可行的。苑琳等[21]利用ISSR分子標記技術對從胡麻枯萎病病株中分離得到的30個菌株進行了遺傳多樣性分析，在相似系數(shù)為0.86處，30個菌株被分為4個群體，此結(jié)果表明，雖然全部供試的30個菌株都屬于鐮刀菌屬尖孢鐮刀菌種，具有比較高的遺傳相似性，但其種內(nèi)仍然具有一定的遺傳多態(tài)性，表明ISSR分子標記技術用于分析胡麻枯萎病菌種內(nèi)的遺傳差異是可行的。苑琳等[22]采用ISSR分子標記技術對尖孢鐮刀菌胡麻?；瓦M行了進一步的研究，對收集的96個病株進行了分析研究，發(fā)現(xiàn)胡麻枯萎病菌種內(nèi)存在明顯的多態(tài)性，同時認為不同來源的尖孢鐮刀菌菌株之間，不僅在形態(tài)性狀方面會呈現(xiàn)一定程度上的差異，而且在分子遺傳水平上也會有很明顯的差異，其基因在SSR區(qū)域上的遺傳多態(tài)性很復雜而且分化很明顯，說明ISSR分子標記技術能夠揭示出各菌株DNA分子水平上的遺傳多樣性，這也表明了ISSR分子標記有很高的靈敏度，能夠用于研究尖孢鐮刀菌種內(nèi)菌株之間的遺傳多樣性。

3 展望

ISSR作為一種新型的分子標記技術，具有簡單、經(jīng)濟、快速、多態(tài)性高、安全性高、重復性好等優(yōu)點，現(xiàn)已在遺傳多樣性分析、植物品種鑒定、基因定位、遺傳作圖、進化及分子生態(tài)學等研究領域中廣泛應用[10]。此外，與依據(jù)形態(tài)學特征進行分類鑒定的分類系統(tǒng)相比，ISSR分子標記能直接檢測到DNA分子結(jié)構上的變異，反映出研究材料本質(zhì)上的差異，而且真菌DNA穩(wěn)定，不容易受到外部環(huán)境的影響，在其任何生活階段都能夠提取獲得，因此，ISSR技術在鐮刀菌屬的分類學研究方面具有重要的應用前景和實用價值。ISSR分子標記技術目前已經(jīng)廣泛應用于多種作物中，但在鐮刀菌遺傳多樣性方面的研究還很不足。我們應借鑒ISSR技術在各種作物中成功應用的經(jīng)驗，再結(jié)合傳統(tǒng)的以形態(tài)學為基礎的分類系統(tǒng)，積極拓寬ISSR分子標記技術在鐮刀菌屬分類研究中的應用深度，促使鐮刀菌屬分類學研究進步和發(fā)展。

[1]Summerell B A,Leslie J F,Backhouse D,et al.Fusarium：Paul E.Neison Memorial Symposium[M].Minnesota:The American Phytopathological Society Press,2001:1-360.

[2]Moss M O,Smith J E.The applied mycology ofFusarium[M].Cambridge:Cambridge University Press,1984:1-264.

[3]張向民.鐮刀菌屬分類學研究歷史與現(xiàn)狀[J].菌物研究，2005，3（2）：59-62.

[4]Wollenweber H W,Reinking O A.DieFusarien,ihre beschreibung,schadwirkung und bekampfung[M].Berlin: Verlag Paul Parey,1935:355.

[5]Burgess L W,Summerell B A,Bullock S,et al.Laboratory manual forFusariumresearch(3rd)[M].Sydney:University of Sydney,1994:1-133.

[6]Nelson P E,Toussoun T A,Marasas W F O.Fusariumspecies:An illustrated manual for identification[M].University Park and London:The Pennsylvania State University Press,1983:1-193.

[7]俞大紱.中國鐮刀菌屬（Fusarium）菌種的初步名錄[J].植物病理學報，1955（1）：1-17.

[8]陳鴻逵，王拱辰.浙江鐮刀菌志[M].杭州：浙江科學技術出版社，1991：1-72.

[9]Leslie J F,Zeller K A,Summerell B A.Icebergs and species in populations ofFusarium[J].Physiological and Molecular Plant Pathology,2001,59(3):107-117.

[10]Tapani Y M,Sari P H,Sergey A B,et al.Molecular,morphological and phylogenetic analysis of theFusarium avenaceum/F.arthrosporioides/F.tricinctumspecies complex-a polyphasic approach[J].Mycological Research,2002,106 (6):655-669.

[11]Pavlina K,Tapani Y M.IGS-RFLP analysis and development of molecular markers for identification ofFusarium poae,Fusarium langsethiae,Fusarium sporotrichioidesandFusarium kyushuense[J].International Journal of Food Microbiology,2004,95(3):321-331.

[12]Visentin I,Tamietti G,Valentino D,et al.The ITS region as a taxonomic discriminator betweenFusarium verticillioidesandFusarium proliferatum[J].Mycological Reseach, 2009,113(10):1 137-1 145.

[13]Guadet J,Julien J,Lafay J F,et al.Phylogeny of someFusariumspecies,as determined by large-subunit rRNA sequence comparison[J].Molecular Biology and Evolution, 1989,6:227-242.

[14]O'Donnell K,Cicugelnik E,Nirenberg H I.Molecular systematics and phylogeography of theGibberella fujikuroispecies complex ofFusarium[J].Mycologia,1998,90: 465-493.

[15]Paavanen-Huhtala S,Hyvonen J,Bulat S A,et al.RAPDPCR,isozyme,rDNA RFLP and rDNA sequence analysis in identification of FinnishFusarium oxysporumisolates[J]. Mycological Research,1999,103(5):625-634.

[16]Zhang B J,Zhang J R,Guo M X,et al.PCR-RFLPs analysis of rDNA ITS ofFusarium(in Chinese)[J].Journal of Agricultural Biotechnology,2007,15(6):545-546.

[17]Zietkiewicz E,Rafalski A,Labuda D.Genome fingerprinting by simple sequence repeat(SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification[J].Genomics,1994,20(2): 176-183.

[18]李蕊倩，何瑞，張躍兵，等.鐮刀菌ISSR標記體系的建立及遺傳多樣性分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2009，42（9）：3 139-3 146.

[19]王建明，李蕊倩，暢引東，等.尖孢鐮刀菌及芬芳鐮刀菌遺傳多樣性的ISSR分析[J].植物病理學報，2011，41（4）：337-344.

[20]段會軍，張彩英，李喜煥，等.基于RAPD、ISSR和AFLP對西瓜枯萎病菌遺傳多樣性的評價[J].菌物學報，2008，27（2）：267-276.

[21]苑琳，路福平，劉珊珊，等.河北省胡麻?；图怄哏牭毒z傳多樣性的ISSR分析[J].CMBB，2010：350-353.

[22]苑琳，劉珊珊，路福平，等.尖孢鐮刀菌胡麻?；停‵usarium oxysporumf.sp.lini）ISSR標記聚類分析[J].中國油料作物學報，2012，34（2）：193-200.

ISSR Analysis on Genetic Diversity ofFusarium

WANG Xianhui1,2,WEI Lin2,LIANG Zhihuai3,CHEN Yurong2,ZHANG Yi1,2
(1.Longping School,Central South University,Changsha 410125;2.Hu'nan Plant Protection Institute; 3.Hu'nan Watermelon and Muskmelon Research Institute)

In this paper,we summarized the progress on studying the genetic diversity ofFusariumby molecular biology methods,and also analyzed the application prospects of ISSR marker on studying the genetic diversity ofFusarium.

Fusarium;ISSR;Genetic diversity

10.3865/j.issn.1001-3547.2012.16.003

國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項經(jīng)費項目“水生蔬菜產(chǎn)業(yè)技術體系研究與示范”（200903017）

王獻慧（1986-），女，在讀碩士，主要從事農(nóng)作物病害生物防治研究，電話：14789761940，E-mail：wangqing.zhi1986@163.com

魏林（1970-），女，通信作者，副研究員，主要從事農(nóng)作物病害生物防治研究

2012-06-27