劉自安 徐戰(zhàn)鋒

酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）是目前血站實驗室最常用的免疫學(xué)檢測方法，由于其試劑穩(wěn)定，易保存，操作簡便，結(jié)果判斷較為客觀［1］，既適宜于大量血液篩查，又可用于少量標(biāo)本的檢測。ELISA試驗以其靈敏度較高、特異性較強(qiáng)，重復(fù)性較好等特點在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用，但影響試驗檢測效果的因素也較多，現(xiàn)就本人在實驗操作過程中常見的影響因素進(jìn)行分析與描述，以提高ELISA檢測質(zhì)量和水平。

1 異常結(jié)果描述

1.1 白板

顯色步驟結(jié)束后，酶標(biāo)反應(yīng)板所有孔均無顏色。

1.2 顯色弱，靈敏度低

1.2.1 實驗結(jié)束后，包括陽性對照、室內(nèi)質(zhì)控在內(nèi)的所有板孔顏色均較淡。

1.2.2 實驗結(jié)束后，陰陽性對照正常，室內(nèi)質(zhì)控正常，但血液標(biāo)本感覺顯色較弱。

1.2.3 實驗結(jié)束后，陰陽性對照正常，但室內(nèi)質(zhì)控品或個別弱陽性標(biāo)本未能檢出。

1.2.4 終止完成后，目測結(jié)果正常，但酶標(biāo)儀讀值偏低，甚至出現(xiàn)多孔負(fù)值。

1.3 靈敏度過高，酶標(biāo)板本底偏高

1.3.1 終止完成后，整板結(jié)果呈現(xiàn)均一的淡黃色或陰陽性對照、質(zhì)控均正常，但陰性標(biāo)本OD值過高。

1.3.2 出現(xiàn)隨機(jī)性的花板及跳孔現(xiàn)象。

1.4 假陽性

假陽性現(xiàn)象是一個綜合現(xiàn)象，可參考上述1.3 中的分析與描述。

2 原因分析

2.1 白板

2.1.1 試劑已過效期，或不同試劑盒組分混用。

2.1.2 錯加、漏加試劑組分。

2.1.3 洗板及加樣過程中，酶結(jié)合物受污染失活而失去催化顯色劑顯色的能力導(dǎo)致。

2.2 顯色弱，靈敏度低

2.2.1 接近或超過有效期的試劑可能會產(chǎn)生很弱的信號。

2.2.2 試劑組分用前未平衡至室溫。

2.2.3 加入試劑的量和順序有誤。

2.2.4 洗板及加樣過程中，酶標(biāo)受污染失活而失去催化顯色劑顯色的能力導(dǎo)致?；蛘唢@色液受到污染。

2.2.5 孵育時間及孵育溫度未達(dá)到規(guī)定要求。

2.2.6 洗板次數(shù)過多，或濃縮洗液稀釋倍數(shù)不符合要求，或者用其他廠家洗液洗板，導(dǎo)致靈敏度偏低。

2.2.7 未達(dá)到要求的孵育溫度及孵育時間可檢出強(qiáng)陽性標(biāo)本，但弱陽性標(biāo)本受溫度變化影響較大而被未檢出。

2.2.8 室內(nèi)質(zhì)控品高溫放置過久或被反復(fù)凍融，致使待測物滴度下降，而未能檢出。

2.2.9 酶標(biāo)儀參數(shù)設(shè)置不正確或濾光片不匹配。

2.3 靈敏度過高，酶標(biāo)板本底偏高

2.3.1 整板出現(xiàn)“黃板”現(xiàn)象

2.3.1.1 錯加其他試劑造成或盛放顯色劑容器受到污染。

2.3.1.2 顯色劑在光照條件下放置過久，實驗前已變藍(lán)。

2.3.1.3 孵育溫度過高或孵育時間過長。

2.3.1.4 未按要求洗板，如用自來水沖洗或者非本公司洗液洗板，特別是洗滌時每孔未注滿洗液，易造成花板黃板現(xiàn)象。

2.3.2 酶標(biāo)板呈現(xiàn)“花板”現(xiàn)象

2.3.2.1 血液標(biāo)本的采集、處理和保存方法不當(dāng)造成。

2.3.2.2 加樣時造成的交叉污染、手工洗板造成的交叉污染、手工拍板時造成的交叉污染以及洗板機(jī)某幾個加液頭堵塞等均可導(dǎo)致“花板”出現(xiàn)。

2.4 假陽性

2.4.1 計算Cutoff 值時使用的公式不正確，導(dǎo)致計算得出的Cutoff值過低，從而導(dǎo)致假陽性出現(xiàn)。

2.4.2 洗板時板孔未能注滿洗液或洗板次數(shù)、浸泡時間不夠，未用試劑盒提供的洗液洗板,導(dǎo)致花板、跳孔，以致假陽性增多。

2.4.3 血液標(biāo)本處理不當(dāng)，如標(biāo)本離心不徹底未完全除去細(xì)胞成分、纖維蛋白原及其它干擾物等，可出現(xiàn)孔底由點變藍(lán)的跳孔現(xiàn)象，此標(biāo)本重復(fù)實驗結(jié)果往往呈陰性反應(yīng)。

2.4.4 廠家試劑本身的質(zhì)量變化造成的假陽性。

3 解決方法（對策）

3.1 白板

3.1.1 每次實驗前應(yīng)檢查試劑各組分及批號，確認(rèn)試劑未過期。不同試劑盒或不同批號的試劑不能混用。

3.1.2 嚴(yán)格按試劑說明書進(jìn)行規(guī)范操作，錯加或漏加試劑組分將會出現(xiàn)白板的異常結(jié)果。加完試劑后可目視一下液面高度是否一致，以避免漏加現(xiàn)象。

3.1.3 疊氮鈉等酶抑制物會使酶標(biāo)記物失活，應(yīng)確認(rèn)盛酶標(biāo)的容器不含酶抑制劑，確認(rèn)配制洗液的容器已洗干凈，確認(rèn)配制洗液用的純化水達(dá)到要求且未受到污染。

3.2 顯色弱，靈敏度低

3.2.1 實驗前檢查試劑的組分及批號，確認(rèn)試劑未過期。

3.2.2 從低溫冰箱中取出的試劑及樣品應(yīng)置室溫平衡30min。

3.2.3 確定所使用的每一種試劑加樣量準(zhǔn)確，且加入順序適當(dāng)。

3.2.4 酶免實驗中的標(biāo)本禁用疊氮鈉作為防腐劑，可選用proclin、硫柳汞等其他防腐劑。

3.2.5 孵育溫度和時間應(yīng)滿足試劑使用說明書規(guī)定的要求。

3.2.6 嚴(yán)格按說明書要求稀釋濃縮洗液及洗板，如濃縮洗液稀釋倍數(shù)、洗滌次數(shù)、浸泡時間等。必須用試劑廠家提供的洗液進(jìn)行洗板。

3.2.7 標(biāo)本若需在一周內(nèi)進(jìn)行檢測的，可暫存于2～8℃，如需長期保存，應(yīng)置于-20℃以下保存。室內(nèi)質(zhì)控品應(yīng)置于-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融。

3.2.8 檢查儀器是否設(shè)定正確，特別是檢查濾光片是否匹配。必要時重新設(shè)定酶標(biāo)儀的參數(shù)，如有懷疑，可重做實驗。

3.3 靈敏度過高，酶標(biāo)板本底偏高

3.3.1 實驗前檢查試劑的組分及批號，確認(rèn)所有組分均屬于對應(yīng)的試劑盒。不同試劑盒或不同批號的試劑不能混用。

3.3.2 避免試劑組分間的交叉污染，確保吸頭、容器干燥潔凈。

3.3.3 顯色劑A和B未使用前應(yīng)避光保存。

3.3.4 孵育溫度和時間應(yīng)滿足試劑說明書規(guī)定的要求。

3.3.5 嚴(yán)格按試劑說明書要求洗板。洗滌時每孔均注滿洗液，洗滌次數(shù)，每次浸泡時間應(yīng)嚴(yán)格掌握。

3.3.6 待檢標(biāo)本的處理方法:室溫下自然放置1~2h再用3000r/min離心15min備用［2］。

3.3.7 加標(biāo)本時應(yīng)避免交叉污染。如盛標(biāo)本的試管周圍常有血痂，易脫落，應(yīng)遠(yuǎn)離酶標(biāo)板。

3.3.8 手工洗板時第一次注洗液后應(yīng)立即棄去，后幾次再設(shè)定浸泡時間，可減少交叉污染。

3.3.9 確保加液頭疏通，洗板時每孔均應(yīng)注滿洗液，洗板完畢拍板時應(yīng)選用合適的吸水紙巾，不可把無關(guān)物質(zhì)拍進(jìn)板孔，并盡量不要在同位置拍打，以免交叉污染。

3.4 假陽性

3.4.1 Cutoff值計算公式應(yīng)嚴(yán)格參照試劑說明書設(shè)置（不同廠家的Cutoff值計算公式不盡相同）。

3.4.2 嚴(yán)格按說明書要求洗板（不同廠家的試劑洗滌次數(shù)、浸泡時間不盡相同）。調(diào)整洗板機(jī)時，應(yīng)注意有時儀器標(biāo)示的液量與實際液量并不相符，應(yīng)根據(jù)實際情況調(diào)整至每孔注滿。

3.4.3 待檢測標(biāo)本應(yīng)放置4℃冰箱保存或新鮮標(biāo)本及時檢測［3］。

3.4.4 當(dāng)國家標(biāo)準(zhǔn)要求提高靈敏度時，廠家試劑的靈敏度也相應(yīng)提高，假陽率常常有所上升，但只要在合理范圍，是可以接受的。

4 討論

全自動酶免分析儀在血站實驗室的普及，極大地促進(jìn)了酶免疫測定技術(shù)的臨床應(yīng)用，實現(xiàn)了ELISA檢測的標(biāo)準(zhǔn)化、減輕了實驗室技術(shù)人員的勞動強(qiáng)度，提高了臨床免疫測定的質(zhì)量和水平［4］。無論怎樣先進(jìn)的儀器都離不開人的操作，再先進(jìn)儀器也不能解決工作中出現(xiàn)的一切問題，ELISA檢測結(jié)果的正確與否對血站來說至關(guān)重要，一方面，假陽性結(jié)果會浪費寶貴的血液資源，另一方面，假陰性結(jié)果則不能確保臨床用血的安全。因此我們在實際操作中只有正確掌握影響ELISA試驗檢測效果的各類因素及其解決辦法，才能更好地操作儀器，提高血液檢測質(zhì)量，確保臨床用血安全。

［1］李楚潮.ELISA,RPR、Trust、TPPA四種方法檢測梅毒螺旋體抗體的結(jié)果分析［J］.當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2010,16（20）：9-10.

［2］中國疾病預(yù)防控制中心.全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范［S］.2004,08:1.

［3］石凌波，崔偉歷，張鳳川.檢驗醫(yī)學(xué)分析前質(zhì)量控制［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2009,08:246

［4］李金明主編.臨床酶免疫測定技術(shù)學(xué)［M］.北京：人民軍醫(yī)出版社，2005,05:148