陳貴元，譚德勇

（1.云南大學生命科學院生物化學與分子生物學實驗室，昆明 650091；2.大理學院基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，云南大理 671000）

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是生物進化過程中遺留下來的一種在轉錄后通過小RNA分子調控基因表達的現象〔1〕。它由雙鏈RNA（double stranded RNA，dsRNA）啟動，在Dicer酶的參與下，把RNA分子切割為小分子干擾RNA（small interfering RNA/shortinterfering RNA，siRNA），并特異性地與mRNA的同源序列結合，從而產生相應的功能表型缺失的現象。根據dsRNA作用效果分為3種類型：阻抑作用、部分降解和完全降解，其共同特點都表現為抑制作用，以達到降解或者關閉特定基因表達的目的。RNA干擾廣泛存在于生物界，在不同物種中RNA干擾被賦予不同的名稱，在植物體中被稱為基因共抑制（co-suppression），在真菌中被稱為基因阻抑（qulling），而在動物體內被稱為RNA干擾〔2-3〕。RNA干擾現象是Fire和Montgomerym〔1〕在1998年2月發(fā)現的，他們將體外轉錄得到的純化后的單鏈RNA和經純化的雙鏈RNA分別注射線蟲時發(fā)現，單鏈RNA對基因抑制效應十分微弱。相反，雙鏈RNA則能高效特異性地抑制相應基因的表達。真菌、植物、水螅、渦蟲、錐蟲（Trypanosoma brucei）和小鼠等大多數生物中均存在RNA干擾現象〔4-6〕。2001年，Elbashir等〔7〕首次用長度約為19～23個堿基對的雙鏈siRNA在哺乳動物細胞中誘發(fā)基因沉默現象，證實哺乳動物細胞中也普遍存在RNA干擾機制，從而引起RNA干擾的研究熱潮。由于幾乎所有的物種都保留著RNA干擾的機制，這揭示了RNA干擾很可能是出現于生命進化的早期階段，而且起著重要的作用，RNA干擾也越來越為人們所重視。本文對當前RNA干擾的研究進行了總結并對其應用前景作了簡要介紹。

1 RNA干擾的作用機制

雖然科學家們運用遺傳學和生物化學的方法來探索RNAi的機制，但RNAi是由dsRNA誘導的多步驟、多因素參與的過程，其真正的機理尚未明了。目前認為其可能分為以下幾個階段進行〔1，8〕。

起始階段。dsRNA進入細胞，被Dicer核酸酶特異識別，以一種依賴ATP的形式將dsRNA切割成長約21～23 nt（或bp）的小片段siRNA，siRNA又被稱為引導RNA （guide RNA），是識別靶RNA（target mRNA）的標志，siRNA的生成啟動了RNA干擾反應。

效應階段。siRNA通過與核酸酶等蛋白質結合形成RNA誘導沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC），并依靠ATP提供能量解開siRNA雙鏈，激活RISC?；罨蟮腞ISC定位到與siRNA中的反義鏈互補的靶mRNA轉錄本上，并在距離siRNA3′端12個堿基的位置切割mRNA，使靶mRNA降解。在RNA干擾的效應階段，RISC復合物起了相當重要的作用。siRNA與RISC復合物形成一種小干擾核糖蛋白粒子（small interfering ribonucleo protein particles，siRPP）。RISC與Dicer都具有RNA酶的活性，但是它們的底物卻不同，RISC常常針對單鏈RNA分子，而Dicer則針對雙鏈RNA分子。另一方面，它們酶切RNA分子的方式和酶切的產物也不同，Dicer屬于RNA內切酶，而RISC則屬于RNA的外切酶。因此，它們是性質和功能各異的兩種酶類復合物。

放大效應。RNA干擾效應階段的mRNA降解產物，反過來可以作為依賴RNA多聚酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP） 的RNA模板，合成雙鏈RNA分子，加入到RNA干擾的啟動階段，從而放大RNA干擾的作用〔9〕。也就是說，在RNA干擾的啟動和效應階段，都存在著siRNA的擴增和RNA干擾的放大效應。另一方面也說明，RNA干擾的啟動和效應階段并不是兩個絕對獨立的過程，而是相互交錯進行的。

2 RNA干擾的作用特點

2.1普遍性RNA干擾的機制廣泛存在于不同物種的細胞內，植物、微生物、動物的細胞內都保留了運行RNA干擾的酶類〔10〕。把長的dsRNA或短的siRNA導入生物體細胞，都可激發(fā)RNA干擾、沉默基因表達。在細胞培養(yǎng)和動物模型的實驗中都證實，siRNA可在多種器官的細胞中，包括肝臟、脾臟、腎臟、血液系統、視網膜、神經系統、胚胎和造血干細胞等抑制特異基因的表達。此外，幾乎所有的基因都能通RNA干擾而被沉默〔4〕。

2.2 RNA干擾的高效性和濃度依賴性RNA干擾抑制目標基因表達的效能非常高，無論是在體內還是體外試驗中，僅需少量的siRNA就能有效地抑制大量靶基因的降解。宋爾衛(wèi)等〔11〕對Fas抗原的siRNA治療小鼠暴發(fā)性肝炎模型實驗中，siRNA的用量比過去文獻報道的反義寡核苷酸的用量少10倍以上，但是卻能達到同樣的抑制效果。這種高效強大的基因抑制功能主要是與RISC降解mRNA的效能強大。siRNA是否能夠比較容易接近mRNA靶目的片段與siRNA分子的穩(wěn)定有關。另外，RNA干擾效應的強度隨著siRNA濃度的增高而增強〔12〕。

2.3高度特異性由dsRNA誘導的RNA干擾只引起與dsRNA同源的mRNA降解，對其它基因的表達不受影響，這是RNA干擾最顯著的特征〔13〕。因為siRNA對mRNA降解的選擇取決于siRNA的特異序列，所以siRNA是嚴格按照堿基配對的法則與靶mRNA結合。RNA干擾的特異性，不僅是siRNA應用于基因研究時能準確剖析具體基因功能的前提條件，也是它用于治療疾病時藥效強大、藥效專一、不良反應小的基本保障。

2.4可遺傳性和時間效應RNA干擾效應可以穩(wěn)定地遺傳給子代，而且存在時間上的效應。1998年Fire等〔1〕在實驗中發(fā)現：在線蟲中，通過注射的方式將siRNA注射到線蟲中能把RNA干擾的現象傳給第2代，但不能傳給第3代。而將dsRNA轉染到體外培養(yǎng)的細胞后，其功能缺失的表型可以持續(xù)9代。哺乳動物細胞中的siRNA干擾具有時間效應，注入dsRNA 2～3 d內，RNA干擾顯著，接下來的1～2 d內，靶mRNA的豐度就能恢復到RNA干擾前的水平。RNA干擾作用的下降甚至消失，可能是由于siRNA活性下降，能被siRNA識別的序列發(fā)生點突變或者產生抗siRNA的抗體所至。

2.5可傳播性RNA干擾信號可以穿越細胞界限，向其它的組織細胞擴散，引發(fā)系統性應答。植物中RNA沉默的一個最顯著特征是通過植物大分子運輸系統進行系統擴散。植物大分子運輸系統有通過胞間連絲（plasmodesmata）進行的細胞間運輸和通過韌皮部（phloem）轉運系統進行的長距離運輸。在植物中，RNA干擾信號可以通過胞間連絲或脈管系統在細胞間傳遞。而在動物中，RNA干擾信號的擴散需要特殊蛋白參與，在膜上形成跨膜通道而傳播到整個機體。Feinberg和Hunter〔14〕通過對sid-1基因（系統性RNA干擾缺陷基因，可以編碼的蛋白質含有11個跨膜結構域）的研究發(fā)現：線蟲細胞膜上的sid-1可以將雙鏈RNA轉運出細胞，雙鏈RNA也可以從起始位置傳播到遠的地方，甚至于全身。在人體和小鼠基因序列中也含有sid-1同源基因，這表明哺乳動物體內也存在全身性的RNA干擾的現象。

2.6 ATP依賴性有研究表明，去除ATP或者抑制ATP合成的復合體的樣品中，RNA干擾現象降低或消失，顯示RNA干擾是一個ATP依賴的過程〔15〕。因為ATP能提供Dicer和RISC的酶切反應所需的能量。研究還發(fā)現，人的Dicer酶優(yōu)先在dsRNA的終末端剪切dsRNA而不需要ATP的參與。這是否表明ATP只對RNA干擾中的某些階段起作用，還有待于更多的實驗來證明。

3 RNA干擾技術的應用前景

3.1基因功能研究上的應用RNAi能夠在真核生物細胞中抑制特異性基因的表達，產生類似基因敲除的效果。隨著現代生物基因測序技術的發(fā)展，大量未知功能的新基因不斷被發(fā)現，研究這些基因的功能是當前生物科學研究的主要方向之一。RNA干擾技術將大大促進對這些新基因功能的研究。與傳統的基敲除技術相比，RNA干擾技術具有投入少，周期短，操作簡單等優(yōu)勢。隨著對RNA干擾機制研究的不斷深入，RNA干擾技術將成為研究基因功能不可或缺的工具。

3.2 RNAi在基因治療方面的應用RNAi具有抵抗病毒入侵，抑制轉座子活動等作用。因此RNAi可利用不同病毒轉錄序列中高度同源區(qū)段相應的dsRNA抵抗多種病毒。腫瘤的發(fā)生是多個基因相互調控作用“失靈”的結果，當前對腫瘤的治療是通過物理和化學的方法抑制DAN復制及細胞分裂增殖，進而殺死癌細胞，然而這些方法不可能完全抑制或逆轉腫瘤的生長。而RNAi可以利用同一基因家族中多個成員具有一段同源性很高的保守序列這一特性，設計針對這一序列的dsRNA分子，只導入一種dsRNA即可以使多個基因同時沉默，從而捉使癌細胞生長停滯。

3.3 RNAi功能基因組研究上的應用在功能基因組研究中，需要對特定基因進行沉默使其功能喪失。利用RNAi高度序列專一性的特點，設計出dsRNA可以特異地使特定基因沉默，從而使特定基因的功能喪失。因此RNAi可以作為一種強有力的研究工具，用于功能基因組的研究。

總之，隨著RNA干擾機制研究的深入和完善，應用RNA干擾技術，必將大力推動人類疾病的治療和人類功能基因組學的發(fā)展。

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