曹中贊，欒新紅，劉勝旺，何劍斌

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110866；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江哈爾濱150001）

支原體（Mycoplasma）也稱霉形體，是一類沒有細(xì)胞壁的原核生物，屬于軟膜體綱，霉形體目霉形體科。雞毒支原體（Mycoplasma gallisepticum，MG）和滑液囊支原體（Mycoplasma synoviae，MS）是兩種重要的家禽病原。MS能夠感染雞和火雞，引起上呼吸道疾病、傳染性滑膜炎和黏液囊炎的發(fā)生，降低產(chǎn)蛋量、蛋品質(zhì)以及孵化率，導(dǎo)致生長(zhǎng)遲緩和飼料轉(zhuǎn)化率降低，降低屠宰時(shí)胴體質(zhì)量，使屠體廢棄率升高［1］，給全球家禽工業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本文就目前MS的流行情況、致病機(jī)制、診斷方法以及防控措施等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了概述，以期更好地檢測(cè)、診斷、凈化和防控禽滑液囊支原體病。

1 滑液囊支原體流行病學(xué)概況

MS一年四季均可發(fā)生，但冬春季節(jié)易發(fā)。各種日齡雞只均易感，尤以雛雞最為嚴(yán)重。禽對(duì)MS感染的抵抗力隨年齡的增長(zhǎng)而加強(qiáng)。病禽和隱性感染禽是本病的傳染源。可以經(jīng)種蛋垂直傳播，也可通過人員、野鳥、飲水、墊料等進(jìn)行直接或間接的水平傳播。飼養(yǎng)管理水平差，生物安全措施不完善，不良環(huán)境因素是導(dǎo)致MS感染流行的主要因素。

MS感染能夠給商品肉雞帶來全身性的損傷，包括黏液囊、肝、脾、腦、眼膜和骨骼肌等，引起氣囊炎和上呼吸道疾病，以及關(guān)節(jié)炎和傳染性滑膜炎的發(fā)生，導(dǎo)致屠宰時(shí)胴體廢棄率上升，甚至?xí)ぐl(fā)免疫系統(tǒng)的抑制［2］。MS感染能夠使產(chǎn)蛋雞群的產(chǎn)蛋量和產(chǎn)蛋品質(zhì)受到損失。Gole V C等［3］應(yīng)用 ELISA檢測(cè)蛋黃抗體的方法對(duì)隨機(jī)挑選的19個(gè)澳大利亞商品蛋雞群進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，MS抗體陽(yáng)性率高達(dá)69%，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明MS血清學(xué)狀態(tài)和一些蛋品質(zhì)參數(shù)如透明度、蛋殼破裂強(qiáng)度、蛋殼反射率和畸形率有一定的相關(guān)性。Feberwee A 等［4－5］研 究 表明，MS感染能夠使商品蛋雞群和肉種雞群的產(chǎn)蛋率降 低、蛋 殼 尖 端 缺 陷 （eggshell apex abnormalities，EAA）發(fā)生率升高。這種影響在意大利的產(chǎn)蛋雞群中也被監(jiān)測(cè)到［6］。

MS在種用雞群和商品代雞群的流行情況不同。多個(gè)國(guó)家的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)表明MS在商品代雞群中有很高的流行率。Hagan等在英國(guó)隨機(jī)檢測(cè)了56個(gè)農(nóng)場(chǎng)的卵黃抗體樣品，有78.6%的農(nóng)場(chǎng)抗體陽(yáng)性。Dufour－Gesbert F等［7］從超過60日齡的法國(guó)某蛋雞群里分離培養(yǎng)了53份樣品，其中有36份是MS陽(yáng)性（68%）。Xavier J等［8］對(duì)阿根廷2003年1月至5月、2004年12月至2005年4月兩個(gè)時(shí)期的庭院養(yǎng)雞的2 441份血清樣品進(jìn)行了MS血清流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)時(shí)期的MS血清抗體陽(yáng)性率分別為68.6%和100%。而祖代和父母代種雞場(chǎng)情況則不同，F(xiàn)eberwee A等［9］在2005年至2006年對(duì)荷蘭一些商業(yè)雞場(chǎng)進(jìn)行了12個(gè)月MS血清流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋雞和肉雞的祖代雞群MS血清陽(yáng)性率分別為0和10%，蛋雞和肉雞的父母代雞群陽(yáng)性率分別為25%和35%，商品蛋雞群和商品肉雞群的陽(yáng)性率分別為50%和73%。由此可以看出，祖代和父母代種雞場(chǎng)由于有著高水平生物安全措施的實(shí)施，以及嚴(yán)格的接觸傳播控制和地理區(qū)域隔離，使得MS的血清陽(yáng)性率低于商品代雞群。

MS目前在我國(guó)還沒有廣泛的流行病學(xué)數(shù)據(jù)，但已有從河南、陜西、北京、廣東、廣西、呼和浩特和上海等地區(qū)分離到 MS的報(bào)道［10］。血清學(xué)調(diào)查表明國(guó)內(nèi)多個(gè)地區(qū)雞群中存在MS感染［11］。

2 滑液囊支原體致病機(jī)理

支原體是最小的自我復(fù)制的微生物，有著非常小的基因組和蛋白質(zhì)組。支原體與宿主的相互作用主要反映在膜蛋白上，膜蛋白負(fù)責(zé)黏附宿主細(xì)胞，而且是宿主免疫應(yīng)答的主要目標(biāo)。在MS方面研究較多的膜蛋白是可變脂蛋白及血凝素蛋白（variable lipoprotein haemagglutinin，Vlh A）［12］。Vlh A 蛋白在介導(dǎo)黏附宿主細(xì)胞以及免疫逃避方面扮演重要角色。Vlh A蛋白經(jīng)過翻譯后切割產(chǎn)生氨基端部分（脂蛋白 MSPB）和羧基端部分（MSPA）。MSPA和MSPB都是表面暴露蛋白，具有高頻率的抗原變異性［13］。5′Vlh A基因區(qū)編碼富含脯氨酸的重復(fù)區(qū)，在不同MS株之間是高度多態(tài)性的，這個(gè)區(qū)域的插入和缺失能導(dǎo)致不同MS株的MSPB長(zhǎng)度發(fā)生變化，此外，5′Vlh A基因區(qū)和基因組假基因的重組能導(dǎo)致MSPB羧基端2／3區(qū)，以及MSPA中的抗原決定簇發(fā)生改變，在不同MS株的MSPA蛋白上有著明顯的抗原差異［14］。迄今為止，只有MSPA被發(fā)現(xiàn)在介導(dǎo)黏附宿主細(xì)胞、以及MS感染的發(fā)病機(jī)理方面有著重要作用。而富含脯氨酸多肽具有免疫調(diào)節(jié)和加強(qiáng)抗體應(yīng)答的效果，推測(cè)MSPB可能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，在MS免疫逃避中有著一定作用［15］。

MS通過MSPA與宿主黏膜表面的受體相結(jié)合是其感染宿主細(xì)胞的第一步，由于MS簡(jiǎn)化的基因組和有限的生物合成能力，需要從宿主那里獲得膽固醇、氨基酸、脂肪酸、維生素、核酸等其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)而生長(zhǎng)繁殖，這一過程可能引起宿主細(xì)胞損傷。而MS細(xì)胞內(nèi)所含的各種外毒素或內(nèi)毒素，如神經(jīng)氨酸酶、過氧化氫酶、卵磷脂酶等酶類以及其自身自然代謝產(chǎn)物，可引起宿主細(xì)胞損傷或死亡。

3 MS診斷方法

控制和清除支原體依賴于準(zhǔn)確及時(shí)地對(duì)感染群體做出診斷。高度敏感、準(zhǔn)確、快速的診斷方法對(duì)MS的監(jiān)測(cè)，最終建立無(wú)MS感染禽群是必須的。MS的診斷方法包括病原的培養(yǎng)和分離鑒定、血清學(xué)診斷以及分子生物學(xué)方法。

3.1 病原培養(yǎng)分離

支原體培養(yǎng)和分離鑒定作為準(zhǔn)確診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，是最可靠最經(jīng)典的診斷方法，常用來進(jìn)行血清學(xué)陽(yáng)性樣本的確認(rèn)。但存在勞動(dòng)量大、浪費(fèi)時(shí)間的缺點(diǎn)。尤其在多種支原體以及其他細(xì)菌混合感染的情況下，它們的分離培養(yǎng)是非常費(fèi)時(shí)和有難度，而且陽(yáng)性結(jié)果的獲得，通常需要4 d～7 d，甚至30 d。

3.2 血清學(xué)檢測(cè)方法

最常用的血清學(xué)檢測(cè)方法包括血清平板凝聚試驗(yàn)（serum plate agglutination，SPA），血凝抑制試驗(yàn)（hemagglutination inhibition，HI），以及酶聯(lián)免疫吸附 試 驗(yàn) （enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）。血清平板凝聚試驗(yàn)主要是檢測(cè)血清中的Ig M抗體，Ig M一般是感染后3 d～5 d出現(xiàn)，持續(xù)70 d～80 d［8］。該技術(shù)快速，方便，在生產(chǎn)上應(yīng)用較多，但由于禽群滅活疫苗的使用、污染的血清以及交叉反應(yīng)，該方法容易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。血凝抑制試驗(yàn)是一種操作簡(jiǎn)易的血清學(xué)技術(shù)，主要檢測(cè)血清中Ig G抗體，具有特異、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，但敏感性差。IgG抗體一般在感染后10 d才出現(xiàn)，該方法不適用于MS感染的早期診斷。此外，該法耗時(shí)較長(zhǎng)，在生產(chǎn)實(shí)踐中的推廣應(yīng)用受到一定限制。MS和MG（Mycoplasma gallisepticum）在血凝抑制試驗(yàn)中沒有交叉反應(yīng)，這有助于 MG和MS感染的區(qū)分。ELISA做為世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）檢疫規(guī)范收錄的MS檢測(cè)技術(shù)，是一種快速敏感的血清免疫學(xué)診斷技術(shù)，為大量樣本的檢測(cè)提供了技術(shù)平臺(tái)。該技術(shù)除可用于檢測(cè)MS感染雞血清中的抗體水平，還可用于蛋黃中抗體的檢測(cè)。蛋黃樣本的檢測(cè)避免了血清樣本的昂貴，血樣采集對(duì)宿主造成的應(yīng)激，人員的培訓(xùn)等弊端。Hagan J C 等［16］對(duì)蛋黃樣本的ELISA檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了評(píng)估，認(rèn)為用氯仿提取卵黃抗體進(jìn)行ELISA檢測(cè)是適合產(chǎn)蛋雞群MS監(jiān)測(cè)的一種有效方法。為解決ELISA用于MS檢測(cè)特異性不強(qiáng)的問題，多位學(xué)者對(duì)用于ELISA的包被抗原進(jìn)行了研究，早期用于檢測(cè)抗體的MS抗原多是一些粗制的、難以確定的膜組份，后來Noormohammad A H 等［17］用 MS代表株 WVU 1853的重組脂蛋白（r MSPB）作為包被抗原，建立了檢測(cè)不同株MS抗體的間接ELISA方法，增強(qiáng)了敏感性和特異性。

隨著技術(shù)的發(fā)展一些先進(jìn)的的血清免疫學(xué)方法不斷被研制出來，Oh K等［18］用 MSPA作為抗原，基于表面等離子體共振成像（SPRi）的蛋白質(zhì)芯片技術(shù)來檢測(cè)雞血清中的MS抗體，這種不用標(biāo)記的高通量方法比ELSIA更可靠，更節(jié)省時(shí)間。但是，世界衛(wèi)生組織僅把血清學(xué)檢測(cè)方法推薦為在群體中進(jìn)行禽支原體篩選監(jiān)測(cè)的工具，而不是個(gè)體診斷的工具。這是因?yàn)檫@些血清學(xué)檢測(cè)方法有著不同的特異性和敏感性。Feberwee A等［9］研究指出不應(yīng)該只依賴于某一種檢測(cè)方法，因?yàn)檫@些檢測(cè)方法存在著不同程度的假陽(yáng)性結(jié)果。Luciano R L等［19］觀察到SPA、HI和ELSIA三種血清學(xué)檢測(cè)方法一致性不顯著，建議陽(yáng)性結(jié)果應(yīng)該用傳統(tǒng)的微生物學(xué)病原分離和鑒定方法以及分子生物學(xué)方法進(jìn)行確定。

3.3 分子生物學(xué)方法

傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室病原分離培養(yǎng)及血清免疫學(xué)檢測(cè)方法耗時(shí)長(zhǎng)、費(fèi)用昂貴，在快速診斷方面存在一定弊端，而且，由于血清學(xué)檢測(cè)方法是針對(duì)抗體進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)，與MG存在明顯的交叉反應(yīng)性，所以，這兩種技術(shù)均不能滿足對(duì)MS進(jìn)行快速確診的要求。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，一些用于檢測(cè)MS的分子生物學(xué)方法相繼被建立起來。最早是用特異性的重組DNA探針來檢測(cè)MS，它們的敏感性是1 ng～2 ng靶DNA分子，相當(dāng)于大約106個(gè)菌落，但這樣大小的菌落數(shù)可能僅出現(xiàn)在急性感染的情況下。為了繼續(xù)提高檢測(cè)方法的敏感性和特異性，有學(xué)者根據(jù)MS的16 SrRNA序列設(shè)計(jì)引物對(duì)MS進(jìn)行PCR檢測(cè)，與病原培養(yǎng)分離以及血清學(xué)方法相比較，這種方法提高了檢測(cè)的敏感性和特異性。但是，由于死亡細(xì)胞的DNA也能夠用PCR方法擴(kuò)增出來，因此，PCR檢測(cè)結(jié)果和細(xì)菌細(xì)胞的活性以及感染性沒有直接關(guān)系。鑒于支原體的r RNA沒有DNA穩(wěn)定，基于MS的16 SrRNA的RT－PCR檢測(cè)方法被建立起來，可以用來檢測(cè)有活性的或者最近死亡的（23 h之內(nèi)）MS細(xì)胞。

MS和MG存在著一定程度上的抗原相似性，用傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測(cè)方法很難把它們區(qū)分開來。而基于16 SrRNA設(shè)計(jì)引物的PCR方法，由于相似性高達(dá)78%，還需要限制性酶切片段分析和特異性探針雜交方法進(jìn)行驗(yàn)證。而且這些方法會(huì)伴隨著其他非相關(guān)細(xì)菌DNA的擴(kuò)增。因此，基于支原體血凝素蛋白基因的PCR檢測(cè)方法相繼被建立起來。Hong Y等［20］根據(jù) MS的vlh A基因建立了真對(duì)不同來源的商業(yè)雞場(chǎng)MS田間分離株進(jìn)行檢測(cè)和分型PCR方法。MS和MG在臨床上常出現(xiàn)混合感染，對(duì)其進(jìn)行快速鑒別診斷是凈化和盡快采取防控措施的前提。Mardassi B B等［21］針對(duì)編碼 MG 血凝素蛋白基因p MGA1.2和MS的vlh A基因保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，建立了多重套式PCR檢測(cè)方法，可以非常敏感和特異性的同時(shí)檢測(cè)這兩種重要的禽類支原體。與常規(guī)PCR技術(shù)相比，多重PCR簡(jiǎn)化了檢測(cè)程序，特別是在臨床癥狀不典型、多種疾病混合感染的情況下，大大提高鑒別診斷的速度，節(jié)約生物試劑和人力資源。

此外，傳統(tǒng)的PCR檢測(cè)方法需要標(biāo)準(zhǔn)的凝膠電泳分析，增加了由于擴(kuò)增子攜帶污染導(dǎo)致的假陽(yáng)性風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real－time PCR）比普通PCR更敏感、更快速，而且不需要擴(kuò)增后的凝膠電泳分析。Jarquin R等［22］基于 MG和 MS的16 SrRNA設(shè)計(jì)引物，建立了Real－time SYBR green PCR分析方法，可以在同一反應(yīng)中檢測(cè)MG和MS，減少對(duì)霉形體暴發(fā)做出準(zhǔn)確診斷的時(shí)間。Sprygin基于MG的mgc2基因和MS的vlh A基因，用Taq Man標(biāo)記的探針作為內(nèi)參照避免了假陰性結(jié)果，建立了高度敏感性、特異性并且重復(fù)性好的多重Real－time Taq Man PCR分析方法，能夠同時(shí)檢測(cè)MG和MS，不僅可以用于商業(yè)雞群和火雞群，而且可以用于鴨和鵝的檢測(cè)［23］。

3.4 其他診斷方法

由于一些國(guó)家和地區(qū)使用致弱的MS活疫苗免疫雞群，疫苗株和田間分離株的鑒別對(duì)流行病學(xué)跟蹤是非常有意義的。基于這種目的，MS限制性內(nèi)切酶多型性分析（RFLP）被建立起來。但RFLP需要病原分離培養(yǎng)，提取基因組DNA，比較浪費(fèi)時(shí)間，尤其是一些單一MS分離株的后代，可能會(huì)發(fā)生基因組重排，導(dǎo)致結(jié)果不可信。為此，一些研究者通過對(duì)MS vlh A基因的單拷貝保守區(qū)進(jìn)行測(cè)序，進(jìn)行MS分型和流行病學(xué)調(diào)查［20］。此外，Jeffery N 等［24］建立了針對(duì)MS vlh A基因的以PCR基礎(chǔ)的單鏈構(gòu)象多態(tài)性和熔解曲線分析技術(shù)，為檢測(cè)和鑒別MS株提供了高分辨率突變檢測(cè)工具。

4 防控措施

良好的飼養(yǎng)管理和健全的生物安全措施是控制禽支原形體病的基礎(chǔ)。此外，還要加強(qiáng)祖代和父母代種雞群MS的流行病學(xué)檢測(cè)，致力于無(wú)支原體感染種雞群的培育。

藥物治療是防治禽支原體感染的一種常用方法，方便、快捷，能及時(shí)減輕已發(fā)病雞群的癥狀。但不同菌株對(duì)抗生素敏感性存在差異，最好對(duì)本場(chǎng)分離的支原體做藥敏試驗(yàn)，選用高敏藥物進(jìn)行治療。Landman W J等［25］體外研究表明17種 MS荷蘭本地分離株以及典型株WVU 1853均對(duì)強(qiáng)力霉素、泰樂菌素和替米考星敏感。

隨著MS耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，以及禽產(chǎn)品的藥物殘留，藥物治療在生產(chǎn)上的應(yīng)用越來越受到限制。人們探討用疫苗接種來防制家禽支原體病，但支原體的培養(yǎng)條件比較苛刻，疫苗的制造成本比較高。目前僅在澳大利亞等國(guó)家有商品化的MS滅活疫苗和弱毒疫苗應(yīng)用［26］。相信隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一些新型疫苗會(huì)被開發(fā)出來。

5 展望

綜上所述，隨著越來越多關(guān)于家禽滑液囊支原體病原學(xué)、流行病學(xué)和感染致病機(jī)理等知識(shí)的積累，一些快速、敏感和準(zhǔn)確的檢測(cè)和診斷方法將會(huì)被陸續(xù)建立，一些新型疫苗將會(huì)被相繼開發(fā)，同時(shí)也會(huì)篩選到一些更高效的治療藥物。支原體自身的變異特性、免疫逃逸功能決定了禽支原體病比急性、烈性傳染病更加難于控制，防控禽支原體病會(huì)是一項(xiàng)長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)、細(xì)致復(fù)雜的工作，要嚴(yán)格做好種用禽群的支原體凈化工作，建立無(wú)支原體感染種禽群，通過環(huán)境控制、有效疫苗免疫和敏感藥物程序性用藥，控制禽支原體病。

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