趙 莉，周 潔，高 誠＊

（1.上海實驗動物研究中心，上海201203；2.揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚州225009；3.中科院上海藥物所，上海201203）

最新的病毒分類第八次報告將腺病毒科分為哺乳動物腺病毒、禽腺病毒（Fowl adenovirus，F(xiàn)Ad V）、腺胸腺病毒、唾液腺病毒4個屬。FAd V現(xiàn)在是指過去的Ⅰ群FAd V，包括傳統(tǒng)FAd V及分離自雞、火雞、鵝和其他禽類的腺病毒，享有一種共同的群抗原。而以前被定義為Ⅱ群FAd V的火雞出血性腸炎病毒、大理石脾病病毒及相關(guān)病毒現(xiàn)在統(tǒng)稱為火雞腺病毒A型，被歸為新立的唾液腺病毒屬。過去將與減蛋綜合征有關(guān)的一類病毒定義為Ⅲ群FAd V，現(xiàn)定名為鴨腺病毒A型，被列入腺胸腺病毒屬。由于FAd V多數(shù)呈隱性感染，不引起明顯臨床癥狀，被認(rèn)為是活病毒載體的候選株。

1 FAd V基因組結(jié)構(gòu)及功能特點

雞胚致死孤兒病毒（Chicken embryo lethal orphan viru，CELOV）是FAd V的代表種，其基因組具有腺病毒科共有的一些特點：①DNA單鏈5′端結(jié)合著由腺病毒編碼的末端蛋白，可提高腺病毒感染性。②DNA兩末端各具一個40 bp～200 bp的abc……c′b′a′型的末端倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列（inverted terminal repeat，ITR）。CELOV 的 54 bp ITR 是DNA復(fù)制的起點。③ 包裝信號φ位于所有已知腺病毒基因組左端100 bp～500 bp之間，在5′ITR附近。④位于基因組兩端的ITR序列和左末端的包裝信號序列共約500 bp是腺病毒的順式作用元件，缺失后不能裝配成有感染性的病毒粒子。

CELOV基因組全長43 804 bp，具有與人腺病毒（Human adenovirus，HAd V）序列同源的L區(qū)和E2區(qū)，位于基因組左中段，而不存在可識別的E1、E3、E4區(qū)。CELOV基因組左末端約5 kb和右末端約12 kb的序列富含開放性讀碼框（ORF），這些ORFs是否有類似于 HAd V E1、E3、E4區(qū)的功能，還有待驗證。位于基因組794 bp處的ORF1編碼一種功能上與d UTP焦磷酸酶同源的蛋白，位于基因組1 999 bp處的ORF2編碼與細(xì)小病毒REP蛋白同源的產(chǎn)物，在基因組右末端的ORF8編碼一種新型抗凋亡蛋白GAM－1，在阻斷細(xì)胞凋亡方面的功能類似于Bcl－2和腺病毒E1B 19 ku蛋白。ORF22編碼一種與E1A蛋白相似的產(chǎn)物，具有誘導(dǎo)凋亡活性，與視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)瘤蛋白相互作用。GAM－1蛋白和ORF22產(chǎn)物對DNA的有效復(fù)制起著重要作用，能激活E2F途徑，促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)化。在兩端邊界序列中，編碼大于99個氨基酸的ORF有22個，已明確研究過功能的卻不多，深入研究這些ORFs顯得非常重要。

2 FAd V載體的研究現(xiàn)狀

FAd V屬包括12個血清型，其中CELOV（FAd V－1）和FAd V－8已完成了全基因組測序，在國外被廣泛的用作FAd V載體研究。

2.1 CELOV（FAd V－1）載體

較早的研究對CELOV基因組序列和結(jié)構(gòu)已有詳細(xì)報道。Michou A I等［1］進(jìn)行了CELOV基因組的突變研究，對含有CELOV兩末端片段的質(zhì)粒載體進(jìn)行突變修飾和插入標(biāo)記基因表達(dá)盒，并酶切線性化CELOV全基因組質(zhì)粒，兩者共轉(zhuǎn)化大腸埃希菌發(fā)生同源重組，產(chǎn)生的重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)鑒定后轉(zhuǎn)染雞肝癌細(xì)胞系（chicken hepatocellular carcinoma cell line，LMH），監(jiān)測各種突變后能否產(chǎn)生有感染力的重組病毒。結(jié)果鑒定了一系列可被缺失但需通過反式提供調(diào)節(jié)因子修復(fù)復(fù)制的病毒復(fù)制必需區(qū)和CELOV基因組右末端的一個復(fù)制非必需區(qū)（40 064 bp～43 685 bp），缺失該3 620 bp片段對病毒在LMH細(xì)胞和雞胚上的復(fù)制沒有可見的影響，并可用于承載外源基因。此外，該研究還證實CELOV載體有效轉(zhuǎn)導(dǎo)多種哺乳動物細(xì)胞，有望替代HAd V5載體用于哺乳動物轉(zhuǎn)基因研究。Francois A等［2］發(fā)展了柯斯質(zhì)粒用作改良的載體構(gòu)建系統(tǒng)，對CELOV基因組中22個未定義的ORFs中的16個進(jìn)行了點突變來研究它們是否為病毒復(fù)制所必需。結(jié)果表明所有16個經(jīng)過突變的CELOV都能在LMH細(xì)胞系上獨立復(fù)制，包括基因組左末端的ORF1～4，12～15和右末端的ORF7～11，16～18，對于這16個ORFs的非必需性，研究者推測一方面可能由于它們在體外細(xì)胞水平不起作用而在病毒進(jìn)入宿主體內(nèi)后的全身作用中才體現(xiàn)功能，如與逃避機體免疫有關(guān)。另一方面，可能這16個ORFs與病毒其他基因（復(fù)制相關(guān)基因）在功能上具有同源性聯(lián)系，缺失其中一個甚至幾個導(dǎo)致的病毒功能喪失可被病毒自身平衡。最后，還有可能是化學(xué)誘變得到的LMH細(xì)胞系特別有利于CELOV的增殖，而使缺失ORF導(dǎo)致的功能異常不易被觀察到或細(xì)胞因子償代了這部分缺失的功能。Washietl S等［3］注釋了CELOV基因組邊界序列中ORFs的特征，有可能揭示FAd V與宿主間作用的新型模式。通過序列分析發(fā)現(xiàn)原屬于平行進(jìn)化同源基因群的一些ORFs出現(xiàn)了極大的功能偏離，包括 ORF2、ORF12、ORF13和ORF14，這些ORFs都具有一個極可能來源于腺相關(guān)細(xì)小病毒的ATPase／helicase區(qū)域，但均不具有ATPase／helicase功能。此外，還確認(rèn)了ORF9、ORF10和ORF11為3個有IG類似區(qū)的假定的I型跨膜糖蛋白，具有補償CELOV缺失的類似哺乳動物腺病毒具備的免疫調(diào)節(jié)功能。ORF16與脊椎動物單一ADP核糖體轉(zhuǎn)移酶有較遠(yuǎn)的同源關(guān)系，故認(rèn)為ORF16在CELOV生活周期具有免疫調(diào)節(jié)或類似功能。合并的ORF18／19編碼了一個假定的甘油三酸酯分解酵素，由于它們只存在于FAd V和馬立克病毒基因組中，可能在感染鳥類中具有特定的功能。Logunov D Y等［4］構(gòu)建了一系列重組CELOV載體并證實即使在體內(nèi)已有HAdv5抗體的情況下它們也能很好的將基因轉(zhuǎn)入各種器官內(nèi)。CELO－p53載體修復(fù)了p53基因抑制腫瘤活性的功能，既能在體外人腫瘤細(xì)胞中也能在移植裸鼠體內(nèi)的異種移植物中發(fā)揮抗腫瘤活性，在裸鼠身上甚至伴隨抑制腫瘤生長的作用。Francois A等［5］將VP2基因置于CMV啟動子之下，分別插入到CELOV 基 因 組1 660 bp～1 989 bp 缺 失 區(qū) 和40 065 bp～43 685 bp缺失區(qū)，構(gòu)建了表達(dá)IBDV抗原基因的重組病毒，通過皮下或皮內(nèi)接種途徑免疫，可保護(hù)SPF雞不出現(xiàn)臨床癥狀和死亡，但不能夠提供完全的保護(hù)力避免法氏囊的病理損傷。Cherenova L V 等［6］構(gòu)建了表達(dá)人白介素2（Ibperleukin－2，IL－2）基因的CELOV載體，但未對CELOV基因組有任何缺失。從體外培養(yǎng)的LMH和293細(xì)胞系上以及雞胚尿囊液中均獲得了重組病毒表達(dá)的有生物活性的IL2產(chǎn)物。在多次瘤內(nèi)注射CELO－IL2重組病毒載體后，患黑色素瘤的C57BL／6小鼠的平均存活時間提高。對于該載體的實際應(yīng)用，研究者建議去除與HAdv5致癌基因E1B和E1A有同源性的CELOV的2個早期基因GAM－1和ORF22。為提高CELOV載體對哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，可以對CELOV的長纖突進(jìn)行改造。構(gòu)建缺失絕大部分病毒基因的無腸型CELOV載體也可延長外源基因的表達(dá)時間并提高載體的包裝容量。在Le Goff F等［7］的研究中，CELOV 基因組右末端約3 620 bp片段缺失后，分別表達(dá)熒光素酶和分泌型堿性磷酸酶的重組病毒的體內(nèi)效應(yīng)被評估。雞群經(jīng)口鼻途徑接種野生病毒和2種重組病毒后，結(jié)果病毒的組織生物學(xué)分布相似。盡管缺失基因組右末端的重組病毒在復(fù)制效率上有所降低，但其承載的異源性抗原能刺激宿主產(chǎn)生相應(yīng)抗體。Shashkova E V 等［8］評估了表達(dá) HSV1腺苷激酶（herpes simplex virus 1－thymidine kinase，HSV1－tk）的重組CELOV載體的抗癌效果。將HSV－TK或增強型綠色熒光蛋白（enhancer green fluorescebp protein ，EGFP）基因插入到CELOV基因組41 697 bp～43 669 bp處，缺失了1 954 bp的復(fù)制非必需區(qū)。CELO－TK載體既能將有功能活性的HSV1－TK產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系中，也能將EGFP和HSV1－TK基因轉(zhuǎn)導(dǎo)至C57／BL6小鼠的皮下黑色素瘤內(nèi)表達(dá)，與抗病毒藥更昔洛韋聯(lián)合用藥，可抑制腫瘤生長。Stevenson M等［9］探索了用非基因性的聚合體包裝CELOV，并用堿性成纖維生長因子重建靶向，實現(xiàn)了載體靶向性的有效改造，并可抵抗預(yù)先存在的免疫反應(yīng)。Rauw F等［10］構(gòu)建了表達(dá)雞γ干擾素（chicken ibperferon－gamma，ChIFN－γ）的 復(fù) 制 型CELOV載體，ChIFN－γ表達(dá)框被插入到CELOV基因組右末端最大的復(fù)制非必需區(qū)D片段中。重組病毒表達(dá)的ChIFN－γ能很好地抑制溶細(xì)胞病毒在雞胚成纖維細(xì)胞和激活的巨噬細(xì)胞上的復(fù)制，并且在體內(nèi)外都很穩(wěn)定。Barra C等［11］初步鑒定了CELOV的順式作用元件。為定位CELOV基因組中編碼病毒殼體化的基因，他們?nèi)笔Я嘶蚪M80 bp～350 bp之間6個不同的區(qū)域來驗證是否能產(chǎn)生活病毒。通過在初步確定的包裝序列假定位置兩側(cè)插入Lox P位點，成功構(gòu)建CELOV輔助病毒，同時建立了相應(yīng)的表達(dá)Cre重組酶的LMH細(xì)胞系。結(jié)果表明基因組左末端200 bp～250 bp和250 bp～300 bp的區(qū)域?qū)Σ《景b分別起著很重要和必須的作用。重組FAd V載體的優(yōu)點之一是可以利用雞胚系統(tǒng)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物。Tutykhina I L等［12］為開發(fā)有效的重組乳鐵蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)，參考前人［5］構(gòu)建重組CELOV載體的方法，缺失了CELOV基因組40 045 bp～43 000 bp的復(fù)制非必需區(qū)并插入了包含人乳鐵蛋白（human lactoferrin，h Lf）基因的表達(dá)盒。用該CELO－Lf重組病毒感染雞胚，感染3 d后即可在尿囊液中檢測到高表達(dá)的h Lf（每胚0.8 mg）。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳、蛋白印跡分析和糖基化分析等方法對尿囊液生產(chǎn)的h Lf和人乳中天然乳鐵蛋白進(jìn)行比較，顯示兩者具有相似的功能活性。利用雞胚系統(tǒng)生產(chǎn)這種結(jié)構(gòu)和功能準(zhǔn)確的h Lf產(chǎn)物，為以后將h Lf用作人用藥物奠定了基礎(chǔ)。

2.2 FAd V－4載體

Schonewille E等［13］將一株毒力很強的 FAd V－4在成纖維細(xì)胞系QT35上傳代適應(yīng)，得到了弱化毒FAd V－4／QT35。用弱化毒感染1日齡雞，未出現(xiàn)臨床癥狀和死亡。然后用雞胚肝細(xì)胞上生長的FAd V－4肌內(nèi)注射未接種弱化毒的21日齡的雞群，結(jié)果出現(xiàn)了高死亡率，而在1日齡接種過弱化毒的雞群未出現(xiàn)死亡。通過酶聯(lián)免疫吸附試驗和病毒中和試驗分析，發(fā)現(xiàn)接種過弱化毒的雞群中僅一部分雞在攻毒前可檢測到微弱的抗體反應(yīng)，在攻毒后體內(nèi)抗體滴度立即升高，另一部分雞雖未檢測到中和抗體仍受到了保護(hù)。而未接種弱化毒的雞群在攻毒后抗體反應(yīng)出現(xiàn)了延遲。這表明中和性抗體對于保護(hù)雞群免受FAd V強毒感染不是必需的，此前未有FAd Vs存在此類現(xiàn)象的報道。Griffin B D等［14］報道了屬于FAd V－C種群的FAd V－4全長45 667 bp的基因組序列，通過生物軟件結(jié)合FAd V－A和FAd V－D種間序列保守性分析評估了FAd V－4基因組序列的蛋白編碼潛力。46個潛在的編碼蛋白的ORFs被認(rèn)定，包括蛋白編碼高潛力的33個ORFs和蛋白編碼低潛力的13個ORFs。其中FAd V－4與腺病毒家族同源的基因，除了少數(shù)幾個，均被認(rèn)定為蛋白編碼高潛力，而FAd V特有的的ORFs分為蛋白編碼高潛力組和蛋白編碼低潛力組。高編碼潛力的基因包括之前報道過的fiber1基因、假定存在的10.3 kb和10.5 kb基因。對被認(rèn)定為低編碼潛力的且長度小于300 bp的上游ORFs中的數(shù)個進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄分析，表明這類在腺病毒科內(nèi)普遍存在的上游ORFS可轉(zhuǎn)錄為重要的mRNA，可能屬于翻譯調(diào)節(jié)因子。這些結(jié)果有助于進(jìn)一步明確FAd V－4的蛋白編碼模式和新一代載體的開發(fā)。Mansoor M K等［15］為開發(fā)針對肉雞心包積水癥的有效疫苗，對FAd V－4弱毒活疫苗與商業(yè)化福爾馬林滅活肝臟苗進(jìn)行了肉雞免疫效果的評估比較。分離自心包積水癥患雞的病毒分離株在雞胚上盲傳4代可獲得雞胚適應(yīng)性，繼續(xù)傳代12次使其完全減毒成為弱毒活疫苗。分別用弱毒活疫苗與商業(yè)化滅活肝臟苗對不帶母源抗體的14日齡肉雞進(jìn)行了免疫。在免疫后的第7、14、21天檢測抗體水平，結(jié)果弱毒活疫苗免疫的雞群與肝臟滅活苗免疫的雞群相比，出現(xiàn)了顯著的高反應(yīng)性（P＜0.05）。對各組肉雞在24日齡時攻毒，并連續(xù)觀察了7 d。弱毒活疫苗對雞群提供了94.73%的保護(hù)率，而肝臟滅活苗對雞群僅提供了55%的保護(hù)率，與弱毒活疫苗比顯著降低（P＜0.05），未免疫的對照組雞群僅有10%的保護(hù)率。證明FAd V－4弱毒活疫苗能產(chǎn)生很好的免疫性，可控制雞群心包積水癥的感染。

2.3 FAd V－8載體

與CELOV 類 似，F(xiàn)Ad V－8基因組中段與HAd V同源性高，含有大量結(jié)構(gòu)蛋白基因，而在基因組左端6 kb和右末端13 kb與HAd V不存在同源性。Johnson M A等［16］將ChIFN－γ插入至FAd V－8基因組右末端一個編碼CELOV 36 ku蛋白類似物的ORF缺失區(qū)，構(gòu)建了3種重組病毒用于表達(dá)雞生長因子。這3種重組病毒在雞腎細(xì)胞生長特性表現(xiàn)出了差異，表明缺失編碼36 ku蛋白類似物的ORF影響病毒在體外的復(fù)制。用表達(dá)ChIFN－γ的重組病毒接種雞群，可增加雞的體重。Johnson M A等［17］將禽傳染性支氣管炎病毒包膜突起蛋白S1亞單位基因表達(dá)盒分別插入FAV－8基因組Sna BⅠ和XbaⅠ位點之間的2.4 kb和SpeⅠ位點之間的50 bp的缺失區(qū)，獲得了2株重組病毒。用重組病毒免疫商品仔雞后，在35日齡時用不同血清型的禽傳染性支氣管炎強毒株攻擊，可達(dá)到很高的保護(hù)率，顯示了FAd V－8用于構(gòu)建重組病毒預(yù)防禽傳染性支氣管炎的潛力。Greenall S A 等［18］將不同的轉(zhuǎn)基因（scFv或scFv－Fc）分別插入到基因組右末端52 bp和2.3 kb缺失處，構(gòu)建了兩個FAd V－8載體。結(jié)果缺失2.3 kb基因的重組FAd V－8載體，成功表達(dá)了分泌型的scFv和scFv－Fc片段，均可在體內(nèi)外中和禽法氏囊病毒。FAd V－8載體在禽體內(nèi)傳遞和表達(dá)治療性分子有較大的開發(fā)潛力。

2.4 FAd V－9載體

OjkicD等［19］研究表明，F(xiàn)Ad V－9在基因組右末端存在兩類串聯(lián)重復(fù)序列區(qū)域，較長的重復(fù)區(qū)（the long tandemly repeated region），TR－2由13個連續(xù)的135 bp直接重復(fù)序列組成，功能未知。將EGFP報告基因插入到FAd V－9的TR－2區(qū)，獲得了缺失TR－2的復(fù)制型重組病毒，證實了TR－2是FAd V－9的復(fù)制非必需區(qū)。在后續(xù)的工作中，Ojkic D等［20］又進(jìn)一步研究了該重組病毒的體內(nèi)作用。肌內(nèi)注射接種野生型或重組FAd V－9后，檢測了病毒在雞體內(nèi)的組織分布和抗體反應(yīng)情況，兩者的結(jié)果均相似，故TR－2區(qū)的缺失不影響FAd V－9在體內(nèi)的分布和誘導(dǎo)相應(yīng)的免疫反應(yīng)。通過一系列基因缺失株的構(gòu)建，Corredor J C等［21］分析了 FAd V－9基因組左末端400 bp～2 782 bp區(qū)域，此區(qū)域包含了包裝信號功能域和一些ORFs。缺失了此區(qū)特定片段的活病毒在體外的生長特性與野生病毒基本類似，但是其中一株缺失了該區(qū)ORFs但保留包裝信號功能域的病毒，在體內(nèi)的復(fù)制特性未能達(dá)到野生病毒的水平，表明此區(qū)的一些ORFs盡管對于FAV－9的體外復(fù)制是非必需的，對病毒的體內(nèi)復(fù)制卻有重要的作用。Corredor J C等［22］又驗證了 FAd V－9基因組左末端的復(fù)制非必需區(qū)，同時檢測FAd V－9在體外的生長特性以及轉(zhuǎn)導(dǎo)非禽源細(xì)胞的能力。在基因組左末端插入EGFP基因表達(dá)盒而未缺失任何區(qū)域構(gòu)建了FAd V－9inEGFP，分別在基因組1194 bp～2 342 bp和491 bp～2 782 bp處插入EGFP基因表達(dá)盒構(gòu)建了FAd V－9△1－EGP 和FAd V－9△4－EGP，這三株重組病毒均具有類似于野生病毒的生長特性，且負(fù)載的EGFP基因在禽源性細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞內(nèi)均可表達(dá)。表明FAd V－9可構(gòu)建成重組病毒載體用于禽類免疫或哺乳動物基因投遞。Corredor J C等［23］構(gòu)建了兩種不同的復(fù)制型重組病毒，并分析了雞群對重組病毒及其表達(dá)的外源基因產(chǎn)物、EGFP產(chǎn)生的抗體情況和雞群糞便排毒情況。結(jié)果在接種重組病毒3周～7周后的雞體內(nèi)檢測到了針對EGFP的抗體，在分別接種重組病毒和野生病毒的雞體內(nèi)均檢測到了針對FAd V－9的抗體，并且抗體產(chǎn)生水平無顯著性差異（P＞0.06）。接種重組病毒的雞群未出現(xiàn)糞便排毒，而接種野生病毒的雞群出現(xiàn)了糞便排毒。這些結(jié)果進(jìn)一步支持了FAd V－9左末端復(fù)制非必需區(qū)適合插入外源基因但對病毒體內(nèi)復(fù)制有重要作用的結(jié)論。

2.5 其他FAV載體

何秀苗［24］確定了FAd V江蘇株基因組的一個復(fù)制非必需區(qū)（40 064 bp～42 284 bp），通過真核細(xì)胞內(nèi)同源重組的方法獲得了表達(dá)EGFP的重組FAd V，為研究FAd V江蘇株的重組基因工程疫苗奠定了基礎(chǔ)。Corredor J C等［25］先后對部分血清型的 FAd V（FAd V－2、FAd V－4、FAd V－8、FAd V－10）基因組左末端和右末端進(jìn)行了序列分析，并與FAd V－1和FAd V－9的序列進(jìn)行了比較。結(jié)果同種群內(nèi)的FAd V（D群的FAd V－2和FAd V－9，C群的FAd V－4和FAd V－10）的核酸序列同源性和氨基酸序列的一致性很高，而不同群的各型FAd Vs之間存在不同程度的差異性。FAV基因組左末端和右末端的基因排列和ORFs的位置較高的保守性暗示了可能具有相似的基因功能。

綜上所述，許多抗原基因已成功克隆到FAd V載體并有效表達(dá)，動物試驗也證實重組FAd V能誘導(dǎo)較高水平的抗體，攻毒保護(hù)效果良好，并具有很好的安全性，因此，F(xiàn)Ad V可作為基因工程重組疫苗的候選載體。

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