鄒海濤，蘭鄒然，姜 平

（1.南京農業(yè)大學動物醫(yī)學院，江蘇 南京 210095；2.山東省動物疫病預防與控制中心，山東 濟南 250022）

新城疫（Newcastle disease，ND），又稱亞洲雞瘟、偽雞瘟，是一種由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的以呼吸道和消化道黏膜出血為特征性病變的烈性傳染病。ND具有高度接觸傳染性，傳播速度極快，急性發(fā)病時病死率接近100%，嚴重危害家禽養(yǎng)殖業(yè)，故世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為必須報告的動物傳染病之一。在我國，ND的暴發(fā)和流行雖已得到較好的控制，但是NDV不同毒株間毒力有較大差異，且在高免疫壓力下，隨著時間推移病毒也隨之發(fā)生著一定的變異，給NDV檢測工作帶來了困難。傳統(tǒng)的病原分離鑒定以及血清學檢測費時費力，且具有一定局限性。隨著分子生物學技術的快速發(fā)展，NDV檢測技術也得到了長足發(fā)展，但是這些新技術在實際應用中都存在一定的缺陷或弱點。因此，深入研究NDV各部分結構及其功能，進而改進現有檢測技術或開發(fā)新的檢測技術已成為目前ND防控工作的一個重點。

1 新城疫病毒的結構

新城疫病毒屬副黏病毒科（Paramyxoviridae）副黏病毒亞科（Paramyxovirinae）禽腮腺炎病毒屬（Avulavirus），病毒粒子外有囊膜，囊膜表面有纖突，其基因組為一長約15kb的單股負鏈RNA。NDV不同毒株其基因組大小略有差異，但各毒株的基因組堿基數均為6的倍數，這種6堿基機制對NDV的復制有著至關重要的作用[1]。NDV的基因組不分節(jié)段，編碼6種結構蛋白：核衣殼蛋白（NP）、磷酸化蛋白（P）、基質蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素－神經氨酸酶蛋白（HN）以及具有RNA依賴性的RNA聚合酶蛋白（L）。P、NP和L稱為內部蛋白，與病毒RNA組成核糖核蛋白體（RNP）；M、F和HN則稱為外部蛋白。

1.1 NP蛋白

NP蛋白是一種與病毒的增殖密切相關的病毒多肽，對病毒核衣殼的形成至關重要[2]。NP蛋白帶有大量電荷，而由大量堿性氨基酸構成的M蛋白帶有強正電荷，二者通過電荷相互作用，將RNP準確的包裝入病毒粒子中。雖然NP蛋白不能對NDV的感染和毒力起決定作用，但NP蛋白與基因組RNA共同組成NP－RNA復合體，作為復制和轉錄的模板，包含免疫顯性抗原決定簇，具有高度的免疫原性[3]，能夠介導細胞免疫作用。NP蛋白mRNA的3＇非編碼區(qū)在強弱毒株間表現出相當大的差異，但能否作為強弱毒判定的標準目前尚無定論。

1.2 P蛋白

P蛋白可與L蛋白形成復合物，產生酶活性。P蛋白作為NP蛋白的分子伴侶能夠阻止NP蛋白在合成之后發(fā)生自動裝配的特性，防止NP蛋白對非NDV RNA進行衣殼化。P基因在轉錄過程中會發(fā)生RNA編輯現象，形成2種衍生蛋白V和 W。V蛋白與NDV的復制和組織嗜性有關，對干擾素有頡頏作用，從而影響NDV的毒力。這種頡頏作用主要與V蛋白位于兩端的4個氨基酸位點有關[4]。此外，W蛋白對NDV的生物活性也有重要的作用[5]。

1.3 M 蛋白

M蛋白是存在于病毒囊膜內層的一種非糖基化蛋白，在病毒裝配的過程中對病毒囊膜的形成、核衣殼與囊膜之間的識別、維持病毒粒子結構完整性有著重要的作用。一系列分子流行病學調查結果顯示M蛋白在不同的NDV分離株中具有極高的保守性。M蛋白還可抑制宿主RNA轉錄和蛋白質的合成，與病毒的致病力有關。Yin R F等[6]借助RNA干擾技術對M基因的第641和第827堿基位點進行特異性沉默，結果發(fā)現病毒復制能力明顯降低。若NDV毒株M基因發(fā)生突變，則該毒株在宿主體內不能出芽，僅表現為持續(xù)性感染。

1.4 F蛋白

F蛋白以纖突形式呈現在囊膜以外，是NDV最重要的毒力蛋白和保護性抗原。不同毒株的F基因序列存在差異，差異越大，毒株間的親緣關系越遠。F蛋白參與NDV與靶細胞作用的過程，使病毒囊膜與宿主細胞膜融合，從而使病毒能穿過宿主細胞膜進入胞漿，脫去核衣殼進行復制。在這個過程中，F蛋白跨膜區(qū)特異性序列起著相當重要的作用，它能夠影響胞外區(qū)活化前的構象以及F蛋白與HN蛋白的相互作用，調節(jié)融合活性[7]。

F蛋白最初是以一種無活性的前體蛋白F0的形式被合成，F0的C端嵌入病毒囊膜之中，而后被細胞內的胰蛋白酶在第112～117位氨基酸殘基處裂解為F1和F2。F1多肽N端插入宿主細胞的脂質層繼而發(fā)揮活性作用，啟動膜融合，NDV才產生感染性。以往普遍認為該裂解位點的氨基酸序列及裂解能力是NDV毒力的惟一決定性因素。不過近年來的研究表明F蛋白的裂解能力并不是NDV毒力的惟一決定性因素[8]。國外學者通過反向遺傳技術將NDV高致病性毒株與非致病性毒株的NP、P、M、L編碼區(qū)進行相應置換，而后將拯救出的病毒接種動物，同時將重組的病毒基因組轉染單層細胞，以評估重組病毒的致病力與復制能力。結果發(fā)現原強毒株重組后，病毒的復制能力降低，致病力有明顯的減弱，相比之下無致病力毒株則呈現了相反情況，特別是在置換了NP、P和L等3個編碼區(qū)后，病毒復制能力明顯增強，致病力變?yōu)樵鹊?0倍[9]。說明真正決定NDV毒力的因素是病毒的復制能力，并非僅僅是F蛋白的裂解能力。

1.5 HN蛋白

HN蛋白是一種既有血凝素（HA）活性又有神經氨酸酶（NA）活性的糖蛋白，是NDV重要的毒力蛋白和保護性抗原。HA活性能夠使病毒吸附到對應靶細胞的受體上，NA活性則破壞細胞受體，從感染細胞表面釋放病毒粒子。同時HN蛋白還能夠促進膜融合，吸引F蛋白充分接近該位點，繼而啟動病毒與細胞膜融合。HN蛋白mRNA的5＇非編碼區(qū)（UTR）是NDV毒力的影響因子之一，若將其缺失，NDV復制不會受到影響，但卻可以降低病毒的致病力[10]。此外，若 HN 蛋白第526位氨基酸發(fā)生突變，HN蛋白的活性將會減弱，NDV的復制將會受其影響，致病力降低[11]。HN蛋白N末端胞內區(qū)的5個氨基酸位點（第1、2、3、4、6位）對病毒與細胞的融合、病毒毒力以及HN蛋白和M蛋白的定位有著極其重要的作用[12]。這一系列研究表明，病毒的組織嗜性依賴于HN蛋白，故HN蛋白是NDV致病力的必需因子，與F基因共同決定著NDV的毒力強弱，進一步印證了F蛋白裂解能力不是NDV毒力唯一決定因素的結論。

1.6 L蛋白

L蛋白是RNA依賴性的RNA聚合酶的主要組成部分，且參與RNA轉錄和復制的大部分酶的活性都來源于L蛋白。秦紅剛等[13]通過RNA干擾技術對位于NDV L基因上的P1595、P2103、P3277等3個酶活性中心區(qū)域進行沉默。結果發(fā)現特異性的沉默這3個區(qū)域的表達會抑制病毒的復制，影響子代病毒粒子的組裝和釋放，說明了P1595、P2103和P3277這3個區(qū)域對于L蛋白發(fā)揮RNA依賴的RNA聚合酶的功能具有重要的作用。此外，國外學者借助反向遺傳學技術發(fā)現L基因可影響病毒復制能力，進而影響NDV的致病力[14]。

2 新城疫病毒的檢測技術

2.1 RT－PCR技術

RT－PCR檢測技術具有快捷、靈敏、特異性強等優(yōu)點，消除了常規(guī)血清學診斷方法中非特異性因素的干擾及敏感性問題，得到了OIE的認可。雖然國內外已建立了許多成熟的RT－PCR方法，但是RTPCR檢測技術在實際應用中出現了各種各樣缺陷，因此仍然需要不斷地對該技術進行改良和優(yōu)化。

Liu H L等[15]根據多個NDV野毒分離株的F基因序列，設計了2對特異性引物并優(yōu)化了反應條件，建立了二重RT－PCR檢測方法，將NDV檢測以及Ⅰ和Ⅱ型NDV的鑒別一次性完成。試驗結果顯示，利用此方法，Ⅰ型NDV參考毒株可擴增出433 bp的特異性條帶，Ⅱ型參考毒株可擴增出535bp的特異性條帶，同批檢測的AIV、IBV、IBDV均無特異性擴增條帶。隨后他們又對67份野毒樣品進行了檢測，檢測結果與病毒基因測序結果相一致。同樣是根據NDV F基因的序列，Zhang L等[16]設計了一條通用上游引物F1和2條特異性下游引物F2、F3，進而建立了半套式RT－PCR檢測方法。先利用引物對F1＋F2確定NDV的存在，進而再用引物對F2＋F3鑒定NDV毒株的毒力。經過驗證，該方法的敏感度要比普通RT－PCR方法敏感1000倍。鑒于NDV感染在臨床上極易與AIV感染混淆，中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所的研究人員根據H5－AIV和H9－AIV的H基因以及NDV的F基因設計了3對特異性引物，建立了三重RT－PCR檢測體系[17]。隨后將該體系與傳統(tǒng)單一RT－PCR檢測體系進行對比，二者的檢測結果完全一致。

2.2 熒光定量RT－PCR技術

Real－time RT－PCR技術是通過借助于熒光信號來檢測PCR產物，提高了靈敏度，實現了真正意義上的DNA定量，具有廣闊的發(fā)展前景。目前，該技術已被應用于包括NDV、PRRSV、CSFV等多種動物疫病檢測。

Wise M G等[18]根據NDV M基因的保守序列設計了引物和水解探針，其檢測敏感度可達到10 EID50。Fuller C M等[19]建立了基于L基因的Realtime RT－PCR方法，如若將其與 Wise M G等建立的方法結合，則基本上可涵蓋所有Ⅰ型和Ⅱ型NDV毒株。在實際工作中，需要判定NDV分離株是否為強毒株。為此，國外在普通Real－time RT－PCR的基礎上發(fā)展出了若干種多重Real－time RT－PCR體系，用以鑒定NDV分離株。Tan S W 等[20]通過分析NDV不同毒力毒株NP基因的序列，設計了2條通用引物以及2條特異性探針，采用SYBR Green I染料建立了兩步法Real－time RT－PCR檢測方法。經驗證，該方法敏感度可達到3×105個病毒拷貝，較普通RT－PCR方法提高了10倍。同樣是使用SYBR Green I染料，Nidzworski D 等[21]則是根 據NDV F基因裂解位點附近的序列設計了一套Realtime RT－PCR檢測方法，對強毒株和弱毒株的敏感度可分別達到102EID50和103EID50。此外，多重熒光定量PCR體系還可用于鑒別AIV和NDV。謝芝勛等[22]根據AIV和NDV的基因保守序列，設計了2對特異性引物和2條用不同熒光基團標記的TaqMan探針，并對反應條件進行優(yōu)化，建立了能夠同時檢測AIV和NDV的二重熒光定量RT－PCR方法，對AIV和NDV的檢測敏感性均可達到2000個拷貝，比常規(guī)RT－PCR敏感性高100倍。

綜合來看，熒光定量PCR技術不僅可以對樣品中的病毒含量進行定量，而且靈敏度高、特異性強、準確可靠、自動化程度高、無污染。但是若待檢樣品數量較大時，單重熒光定量PCR的成本耗費較高，經濟性偏低。因此高通量、低成本、高效率的多重熒光定量PCR檢測技術更值得進一步發(fā)展和推廣。

2.3 環(huán)介導逆轉錄等溫擴增技術

環(huán)介導逆轉錄等溫擴增（RT－LAMP）是近年來新興的一種快速DNA擴增技術，其基本原理在于利用4個特殊設計的引物和具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件下對靶序列進行擴增。RT－LAMP技術具有特異性強、敏感性高、反應迅速、設備要求低等特點。目前，該技術在人類病毒性疾病的診斷領域有著廣泛的應用，但是在動物病毒性疾病診斷領域尚處在嘗試階段。

Pham H M等[23]設計了一套以NDV F基因為靶基因的RT－LAMP特異性引物，僅需將反應體系水浴加熱2h，即可完成檢測，檢測敏感度可達到0.5pg DNA，其特異性與敏感性均達到了套式RTPCR水平。陳安莉等[24]根據NDV F基因的8個區(qū)段設計了可鑒別強弱毒株的3套特異性引物，建立了可區(qū)分NDV的強弱毒株的RT－LAMP檢測法，檢測的靈敏度可達到0.01pg病毒RNA，是普通RT－PCR檢測的100倍。

此外，通過添加Loop引物，反應速度可進一步提高，縮短約一半的反應時間；而改變反應體系中各組分濃度則可控制假陽性結果出現幾率，進一步提高檢測的準確性。

2.4 生物芯片技術

生物芯片技術是是近年來分子生物學及醫(yī)學診斷技術的重要進展，根據點在芯片上的探針的不同分為基因芯片、蛋白質芯片、細胞芯片及組織芯片等，具有高通量、高靈敏度、自動化、微型化等特點，操作簡單，成本較低。

Wang L C等[25]首先根據NDV F基因和AIV M基因的保守序列設計出通用引物，根據NDV F蛋白裂解位點和AIV HA蛋白裂解為點的序列設計出特異性探針，后進行PCR擴增制備靶基因并純化，以點樣儀將制備的靶基因點制在基片上成功制備了基因芯片。該芯片可同時檢測NDV、H5和H7亞型AIV，并可對NDV進行強弱毒株鑒別，檢測結果肉眼即可觀察，無須借助其他設備。隨后的驗證試驗證明該芯片具有良好的敏感性和特異性。石霖等[26]則將AIV和NDV的蛋白抗原先進行純化，用點樣緩沖液稀釋后點于醛基修飾的片基上，制備了國內第一種可視化蛋白芯片。芯片與待檢血清雜交后，再與二抗雜交，銀染顯色后根據灰度值判定結果，從而實現了檢測結果的可視化，使用極其方便。采用該方法對18份血清樣品進行初步檢測，結果顯示該芯片可特異性的與相應的抗體雜交，無交叉反應，而且呈現較強可視化信號。與瓊擴（AGP）抗體檢測進行的符合率比較顯示該可視化蛋白芯片具有很好的特異性，檢測靈敏度至少為AGP法的400倍。

2.5 膠體金試紙

膠體金試紙是將單克隆抗體技術、金標（將單克隆抗體、多克隆抗體與金離子結合在一起）技術、紙上層析技術組合起來的一種新的技術，它以膠體金為顯色劑，利用抗體和抗原反應原理來捕捉病毒并顯色的。膠體金試紙具有快捷、敏感、準確、廉價、穩(wěn)定等一系列優(yōu)點。目前頂尖的科研機構和公司的產品對NDV的測定靈敏度達3×103EID50，而且部分商品化試紙條能夠同時檢測AIV和NDV。李蓓蓓等[27]研制的NDV－AIV復合型膠體金免疫層析檢測可在10min中完成對2種疾病的檢測，NDV的檢測靈敏度為傳統(tǒng)血凝血抑試驗的8倍，重復性、穩(wěn)定性以及特異性均達到了理想水平。因此，膠體金試紙是一種非常適合于基層NDV防控檢測的技術手段。

2.6 聯合檢測技術

除了前文中所述技術，部分單位和機構還將多種檢測技術或平臺相結合，建立了一些聯合檢測平臺，例如PCR－DHPLC（PCR－變性液相高效色譜）聯合檢測[28]、免疫 PCR[29]、流式微球免疫檢測[30]等。這些聯合檢測法最大的優(yōu)勢在于極高的檢測敏感度，其中的一些方法其敏感度可達到10－1.5ELD50／0.1mL。雖然這些方法在檢測的敏感度和準確性上達到了較高的水平，但是這些方法都需要昂貴的儀器設備和試劑，檢測成本較高，并且對操作人員的水平要求較高，因此并不適用于基層檢測，而更適用于出入境檢驗檢疫檢測。

3 結語

近年來國內外對NDV的結構及其相應的功能的研究取得了一定的研究成果，但這仍然是需要研究者們不斷探索的領域，特別是NDV的基因組學及蛋白組學。只有更進一步的搞清NDV的分子生物學特性，才能研究出更好的檢測技術及防控措施。NDV的防控工作仍然任重道遠。從目前國內的實際情況來看，NDV的檢測應該形成更加完善的體系，可以根據不同的檢測目的和要求，采取不同的檢測技術措施。對于基層，可以采取低成本、設備要求低、便于操作、高準確性的檢測方法，如膠體金試紙、多重RT－PCR、RT－LAMP等；而對于大面積疫病監(jiān)測以及出入境檢疫，則可以選擇高通量、高效率、高靈敏度、高穩(wěn)定性的檢測平臺，如熒光定量RTPCR、生物芯片、PCR－DHPLC等。

值得注意的是隨著對NDV結構蛋白功能研究的深入，F蛋白裂解位點附近的氨基酸序列不再是毒力強弱的惟一判定標準。因此，具有更高適用性的NDV強弱毒株鑒別檢測技術的研究工作也許將會是下一步NDV防控工作的核心內容。

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