鄧 宇，藺 濤，孫春清，張宏彪，張 榮，龍進學，黃 律，文心田，曹三杰，童光志，袁世山，鄭 浩＊

（1.四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，四川 雅安 625014；2.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；3.西昌學院動物科學學院，四川 西昌 615000；4.南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，江蘇 南京 210095）

牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）是單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科（Flaviridea）瘟病毒屬（Pestivirus）成員，當前被分為2個種，BVDV－1和 BVDV－2[1]。BVDV 基因組全長約為12.3kb～12.5kb，由一個大的開放閱讀框（open reading frame，ORF）和5′與3′非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）所組成。該病毒ORF編碼約4000個氨基酸殘基組成的多聚蛋白，在病毒非結(jié)構(gòu)蛋白與宿主細胞信號肽酶作用下，加工成BVDV結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，依次為p20（Npro）、C，gp48（Erns）、gp25（E1）、gp53（E2）、p7、p125（NS2－3（NS2，NS3））、p10 （NS4A）、p30 （NS4B）、p58（NS5A）、p75（NS5B）[2－3]。其中，E2（gp53）是 BVDVs亞型分類的依據(jù)之一，也是主要保護性抗原[4－5]。BVDV除引起牛感染外，還能引起野生反芻動物、兔、綿羊、山羊、豬等動物感染。豬感染BVDV會出現(xiàn)類似豬瘟的臨床癥狀與病理變化[6]，給養(yǎng)豬業(yè)帶來危害。近3年來，流行病學調(diào)查結(jié)果表明，我國豬群中BVDV感染已經(jīng)比較嚴重，送檢的樣品中，部分批次樣品陽性率高達80.72%[7－9]。近4年來，我們實驗室對來自我國11省份的豬病料樣品進行BVDV檢測，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，部分豬場BVDV感染很嚴重，高達79.3%。我們從這些陽性病料中分離鑒定出一株BVDV SD0803，基于此，我們根據(jù)此毒株E2基因表達蛋白免疫兔制備多克隆抗體，為豬源BVDV快速診斷提供一種參考方法，為豬源BVDV病原學研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、細胞、實驗動物 豬源BVDV SD0803株由本實驗室分離鑒定；BVDV NADL標準毒株，購自中國獸醫(yī)藥監(jiān)察所；MDBK細胞，購自美國ATCC，經(jīng)本實驗室建立的Nested－PCR與直接免疫熒光（Direct FA）檢測均為BVDV陰性；實驗兔，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。

1.1.2 主要試劑 馬血清（經(jīng)檢測BVDV抗原抗體呈陰性），PBS購自 GIBCO公司；RPMI－1640培養(yǎng)基，購自Hyclone公司；FITC標記BVDVs抗體，購自美國 VMRD 公司；pGEX－4T－1、BL21、DH5α，購自康為世紀生物科技有限公司；EcoRⅠ和XhoⅠ，購自Thermo公司；QIAamp?Viral RNA Mini Kit，購自QIAGEN公司；AMV反轉(zhuǎn)錄酶、LA Taq聚合酶，購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計及合成 根據(jù)GenBank中公布的多個BVDV－1毒株的全長序列進行比對，用Primer Premier 6.0設(shè)計2對特異引物擴增SD0803株E2基因，預(yù)期擴增約1400bp，引物序列分別為：F1975，5′－CCC（TC）GG（GT）A（AG）（GA）TT（TC）GACACCAATGC－3′；R4014，5′－CTGTC ACATA（GA）CTA A（CT）CATCAG－3′；F2249，5′－GACCA（AG）ATTGGTGGCCTT ATGAGAC；R3640，5′－A（CT）T（GA）T（CT）ATG（TG）GTTA（GA）CAAGTTGCC－3′。

根據(jù)上述引物擴增SD0803E2基因序列，采用DNA Star軟件預(yù)測分析，選擇表達蛋白抗原性、親水性較好的序列設(shè)計合成一對引物，用于擴增表達蛋白的靶基因（sE2），預(yù)期擴增約735bp，其引物序列 為 E2－F：5′－AGCGAATTCTTTGA ACAACT CTTCAATGGG－3′；E2－R：5′－AGCCTCGAGTT AGTACTCCCCTTTTAA CATA－3′，其中，在上下游引物分別引入EcoRⅠ和XhoⅠ限制性酶切位點（下劃線標識）和3個保護性堿基，引物均由Invitrogen（上海）公司合成。

1.2.2 E2基因PCR擴增 用 QIAamp?Viral RNA Mini Kit按照操作說明書提取SD0803株MDBK細胞培養(yǎng)上清RNA。以R4014為反轉(zhuǎn)錄引物，參照AMV反轉(zhuǎn)錄酶操作說明書，進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。然后分別以 F1975／R4014，F(xiàn)2249／R3640為引物進行 RT－PCR、Nested－PCR擴增，方法按LA Taq聚合酶說明書進行。RT－PCR擴增條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min 35個循環(huán)；72℃延伸10min。套式PCR擴增條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min 30s35個循環(huán)；72℃延伸10min。擴增結(jié)束后取5μL Nested－PCR反應(yīng)產(chǎn)物，用10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測。用DNA膠回收試劑盒純化Nested－PCR產(chǎn)物，直接送純化產(chǎn)物至Invitrogen（上海）公司測序，分析測序結(jié)果，確定SD0803E2基因。

1.2.3 sE2基因PCR擴增 以Nested－PCR純化產(chǎn)物為模板，以E2－F與E2－R為PCR擴增引物，按LA Taq聚合酶說明書進行PCR擴增，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；95℃30s，58℃45s，72℃45s35個循環(huán)；72℃延伸5min。反應(yīng)結(jié)束后取5μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物，用10g／L瓊脂糖凝膠電泳，鑒定擴增產(chǎn)物的大小正確后DNA膠回收試劑盒回收、純化。

1.2.4 重組表達載體pGEX－4T－1－sE2的構(gòu)建 純化產(chǎn)物（sE2）用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ與XhoⅠ雙酶切后與用相應(yīng)限制性內(nèi)切酶處理的pGEX－4T－1載體連接，22℃連接過夜。65℃滅活10min后，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞，37℃生長過夜，隨機挑取克隆，提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ與XhoⅠ對質(zhì)粒雙酶切，鑒定正確的重組質(zhì)粒送Invitrogen（上海）公司測序。

1.2.5 SD0803sE2基因誘導表達及表達產(chǎn)物純化將重組質(zhì)粒pGEX－4T－1－sE2接種至3mL TB培養(yǎng)基（含氨芐抗性）中37℃培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)過夜，次日取該菌液按1∶100的比例加入300mL LB培養(yǎng)基（含氨芐抗性）中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.5～0.6時，加入1.5mmol IPTG進行誘導表達。37℃誘導4h后收菌，表達產(chǎn)物采用文獻[10]所述方法，進行純化，獲得的產(chǎn)物命名為rsE2。采用SDS－PAGE對純化蛋白進行分析。

1.2.6 抗rsE2蛋白多克隆抗體的制備及純化 首次免疫，取rsE2蛋白與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化，500μg／只的劑量多點皮下接種兔。間隔3周后，用rsE2蛋白加等體積弗氏不完全佐劑充分乳化后，加強免疫3次，按250μg／只劑量皮下接種兔。末次免疫后1周，兔心臟采血，分離血清，制備抗體，置－20℃保存。

利用5mg rsE2蛋白制備抗原交聯(lián)柱，抗血清經(jīng)過5000r／min離心15min，濾紙過濾后，用10倍柱體積的1×PBS平衡交聯(lián)柱，然后抗血清過柱兩次，再用含1mol／L NaCl的PBS緩沖液清洗柱子，然后用100mmol／L的1×Glycine－HCl（pH2.3）洗脫抗體，收集洗脫抗體用Tris緩沖液平衡至中性。隨后在1×PBS溶液中透析2h，再在含550mL／L甘油的PBS溶液中透析4h～8h，收取抗體，置－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 多克隆抗體的鑒定

1.2.7.1 間接ELISA抗體效價的測定 參照文獻[11]所建立間接ELISA方法，以SD0803MDBK細胞培養(yǎng)上清作為包被抗原建立間接ELISA，檢測兔抗血清的抗體效價及特異性。

1.2.7.2 Western blot抗體特異性檢測 將rsE2蛋白進行SDS－PAGE電泳，然后以濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)到NC膜上面；經(jīng)50g／L脫脂奶粉室溫封閉2h后，用兔抗rsE2純化抗體為一抗，F(xiàn)ITC標記的羊抗兔IgG作為二抗，按文獻[10]所述方法進行 Western blot分析。

1.2.8 BVDV 抗原的檢測 將SD0803、NADL分別接種基本長滿單層的6孔板MDBK細胞，3d后，用甲酮固定，所制備的多抗為一抗，F(xiàn)ITC標記的羊抗兔IgG為二抗，做間接免疫熒光試驗。

2 結(jié)果

2.1 SD0803E2及sE2基因擴增

采用套式PCR擴增SD0803的E2基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到約1400bp條帶，與預(yù)期大小一致（圖1），送其產(chǎn)物測序，得到的序列為SD0803 E2基因序列。PCR擴增sE2基因，獲得預(yù)期的735 bp條帶（圖2）。

圖1 SD0803E2基因擴增Fig.1 Amplification of E2gene of SD0803

圖2 SD0803sE2基因擴增Fig.2 Amplification of sE2gene of SD0803

2.2 重組表達載體pGEX－4T－1－sE2的構(gòu)建

SD0803sE2基因與pGEX－4T－1構(gòu)建重組表達載體，獲得的陽性克隆送公司測序，測序結(jié)果表明，sE2基因插入的位置、大小均正確，證實重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，命名為pGEX－4T－1－sE2。

2.3 SD0803sE2基因誘導表達及重組蛋白的鑒定

重組質(zhì)粒pGEX－4T－1－sE2經(jīng)誘導表達，獲得的蛋白表達產(chǎn)物進行純化，其中，上清Ⅰ為超聲波破碎細胞，10000r／min離心10min后收集得到的上清液；加1×PBS重懸沉淀后，加入尿素，充分溶解沉淀，相同條件超聲波破碎細胞，10000r／min離心10 min后收集的上清液，此上清為上清Ⅱ。用SDSPAGE電泳分析，獲得分子質(zhì)量約為52ku誘導表達產(chǎn)物，與預(yù)期大小一致（圖3）。

圖3 SD0803sE2基因表達產(chǎn)物SDS－PAGE分析Fig.3 Analysis SDS－PAGE of expression product of SD0803sE2gene

2.4 抗rsE2蛋白多克隆抗體的制備

采用建立的間接ELISA，測定末次免疫1周后分離的抗血清，其抗體效價可達1∶256000，表明制備的抗體有較高的效價。

2.5 抗體特異性鑒定

2.5.1 Western blot分析 Western blot發(fā)現(xiàn)，一抗（抗血清純化獲得的抗體）1∶1000稀釋，亦能出現(xiàn)約52ku特異性條帶（圖4），結(jié)果表明，制備的多抗具有良好的特異性與較高的效價。

圖4 抗體Western blot分析Fig.4 Analysis of antibody by Western blot

2.5.2 BVDV抗原檢測 間接免疫熒光試驗結(jié)果，SD0803株、NADL標準株感染的MDBK細胞內(nèi)出現(xiàn)特異性綠色熒光，結(jié)果表明，多克隆抗體分別能特異結(jié)合MDBK后分泌產(chǎn)生的E2蛋白（圖5）。

圖5 BVDV E2蛋白在MDBK細胞中表達的免疫熒光檢測Fig.5 Detection of BVDV E2protein expressed in MDBK with immunofluorescence assay

3 討論

BVDV E2是病毒的主要保護性抗原，其編碼的蛋白gp53是囊膜糖蛋白，受糖基化的影響，分子質(zhì)量為51ku～58ku之間，介導免疫中和反應(yīng)、決定BVDV抗原性及其抗體、宿主細胞識別、吸附的主要部位[12－14]。gp53具有中和作用，其N端有2個抗原域（antigenic domain），一個是種內(nèi)保守的主要抗原域，另一個是不同毒株之間的特異性抗原域；其C端存在YYEP線性表位，在豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、邊界病毒（Border disease virus，BDV）及BVDV這3種病毒內(nèi)具有高度保守性，這一蛋白可作為特異性診斷工具[15]。最新試驗證實，BVDV Manasi株 E2pET－（144～340）、pET－（1～300）誘導表達的融合蛋白均能被BVDV陽性血清識別[16]。通過去除BVDV Changchun184E2基因3′端編碼的gp53蛋白跨膜疏水區(qū)序列，可以使該蛋白在大腸埃希菌中高效表達[17]。鑒于上述研究結(jié)果，本試驗選取gp53蛋白56～324區(qū)段（sE2）表達的蛋白免疫兔，結(jié)果表明，獲得的抗體能被SD0803、BVDV標準毒株NADL識別，這一結(jié)果證實所制備的抗體具有良好特異性和較高的效價。

構(gòu)建的表達載體采用不同濃度的IPTG、不同誘導時間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在37℃條件下，加1.5 mmol／L IPTG誘導4h，表達的蛋白量最多。誘導表達的蛋白經(jīng)SDS－PAGE分析，發(fā)現(xiàn)以包涵體形式存在。由于包涵體除了含目的蛋白之外，還包含有其他成分比如細菌膜蛋白、肽聚糖、脂多糖及脂質(zhì)等。一般情況下，在包涵體溶解之前可用低濃度的尿素做變性處理，溶解包涵體，可以除去大部分雜質(zhì)。所以本試驗中，將獲得的包涵體用尿素法進行2次洗滌，以去除雜質(zhì)，然后利用GST蛋白標簽柱層析法純化包涵體，從SDS－PAGE電泳結(jié)果來看，過柱純化后包涵體蛋白雜質(zhì)明顯減少，rsE2蛋白純化是成功的。

獲得的抗血清，在檢測其抗體效價時，為了避免非特異性反應(yīng)，準確測定抗血清效價，我們選用BVDV SD0803MDBK細胞培養(yǎng)上清作為檢測抗原包板進行間接ELISA。經(jīng)檢測，獲得高達1∶256000效價的抗血清。在多克隆抗體鑒定方面，采用3種方法，即間接ELISA、Western blot、免疫熒光法對多克隆抗體進行鑒定，結(jié)果證實制備的多克隆抗體具有良好的反應(yīng)性和特異性，為下一步建立豬源BVDV特異性診斷方法奠定了基礎(chǔ)。

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