李 軍，陶 立，蘭美益，陳澤祥，韋志鋒，秦若甫，彭 昊，楊 威＊

（1.廣西獸醫(yī)研究所，廣西 南寧 530001；2.廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點實驗室，廣西 南寧 530001）

傳染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）是雞傳染性法氏囊病（Infectious bursal disease，IBD）的病原體。IBDV感染幼齡雞后，主要在法氏囊髓質(zhì)區(qū)的未成熟B淋巴細胞和B淋巴細胞前體細胞中增殖，引起感染細胞的變性和壞死，臨床上出現(xiàn)以法氏囊水腫、出血和萎縮為特征的病理變化[1－2]。IBDV在雞群中的傳播不僅導致易感雞群的大量死亡，IBDV的殺淋巴細胞作用還能引起雞群的免疫應答能力降低，使雞群對其他病毒或細菌感染的敏感性增加，給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[3－4]。近十幾年來，隨著IBDV疫苗的廣泛應用，IBDV在疫苗免疫選擇壓力下，自身不斷發(fā)生變異，毒力獲得增強，出現(xiàn)經(jīng)典毒株（classical IBDV，cIBDV）向超強毒株（very virulent IBDV，vvIBDV）的演化，vvIBDV可以突破高水平的母源抗體保護，導致雞發(fā)病年齡提前和病死率增高，給IBD的防控帶來了困難。

IBDV屬于雙RNA病毒科、禽雙RNA病毒屬成員，基因組由A、B兩個雙鏈RNA片段組成[5]。A片段的VP2基因是IBDV主要結(jié)構(gòu)蛋白VP2的編碼基因，VP2蛋白位于病毒粒子的外表面，是IBDV的主要毒力因子，能誘導細胞凋亡和誘導產(chǎn)生保護性中和抗體[6]。研究證實VP2序列中的VP2高變區(qū)（vVP2）與IBDV的毒力密切相關(guān)。vVP2位于VP2蛋白的第206～350位氨基酸之間，由大小兩個親水區(qū)和一個七肽區(qū)組成，構(gòu)成一個構(gòu)象依賴型的抗原表位，誘導機體產(chǎn)生中和抗體。vVP2內(nèi)氨基酸的改變會引起IBDV 毒力的改變[7－9]。

陽秀英等和何秀苗等2000年—2007年對廣西雞群IBDV的分子流行病學研究表明，廣西雞群中主要流行vvIBDV，各地毒株來源復雜，部分IBDV毒株的抗原性可能發(fā)生漂移[10－11]。2011年7月，廣西南寧市某養(yǎng)雞場飼養(yǎng)的23日齡三黃雞暴發(fā)了一起IBD，病死率為6%。本研究對病死雞進行了IBDV分離和鑒定，并對其vVP2進行克隆和測序，將獲得的vVP2序列與廣西流行的IBDV毒株vVP2序列進行比較分析，建立遺傳進化樹，從分子水平上對廣西近期IBDV的變異情況進行追蹤和分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 來自廣西南寧市某養(yǎng)雞場的臨床疑似IBD的病死雞，采其法氏囊作為病料。

1.1.2 雞胚 9日齡健康雞胚，購自廣西華桂源種禽有限公司。

1.1.3 試劑和儀器 PCR Taq mix、DNA Marker 1、DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自廣州東盛生物科技有限公司；病毒基因組DNA／RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；pMD18－T載體、RNA酶抑制劑和 MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自寶生物工程（大連）有限公司；PCR儀購自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒分離 病毒的分離方法按陽秀英等的方法進行[10]。

1.2.2 病毒分離株RNA的提取 用病毒基因組DNA／RNA提取試劑盒提取接種病毒的雞胚尿囊液中的總RNA，方法按說明書進行。

1.2.3 病毒分離株vVP2基因的擴增、克隆和測序按韋平等的方法進行IBDV的RT－PCR檢測[12]。利用DNA膠回收試劑盒回收PCR擴增產(chǎn)物?；厥占兓笈cpMD－18T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α，用質(zhì)粒小量抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切和PCR鑒定后，將陽性重組質(zhì)粒送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.4 分離株vVP2序列的遺傳進化分析 應用DNA Star軟件包的MegAlign軟件對測序獲得的vVP2片段序列與GenBank登錄的5株IBDV疫苗株和26株2000年—2010年在廣西流行的IBDV野毒株的vVP2序列進行核苷酸和氨基酸的序列比較和同源性分析，繪制遺傳進化樹。分析中應用的毒株信息見表1。

表1 所用的IBDV毒株信息Table1 The information of IBDV strains used in this study

2 結(jié)果

2.1 病毒分離和鑒定

發(fā)病雞的法氏囊研磨過濾后經(jīng)絨毛尿囊膜途徑接種9日齡健康雞胚，雞胚在43h后死亡，胚體表現(xiàn)為水腫和出血。取尿囊液進行血凝試驗和細菌培養(yǎng)檢測均為陰性。應用韋平等[12]的方法對雞胚尿囊液進行IBDV的RT－PCR檢測，擴增出471bp的目的片段，證實從病料中分離到了IBDV，將此毒株命名為NN1107。

2.2 分離株vVP2序列的比較分析

2.2.1 核苷酸序列同源性比較 對NN1107分離株的vVP2進行克隆和測序，獲得了NN1107分離株vVP2核苷酸序列，長度為471bp。對序列進行限制性內(nèi)切酶酶切位點檢測，在271位核苷酸處有一個vvIBDV的特征性SspI酶切位點。將此序列與廣西野毒株和疫苗株的核苷酸序列進行同源性比較，NN11017株與廣西vvIBDV毒株的同源性在96%～99.6%之間，其中與野毒株 NN07122和HP1001的同源性最高，為99.6%。NN1107株與廣西cIBDV毒株的同源性在90.3%～91.6%之間；與疫苗株的同源性則在90.3%～96.6%之間。

2.2.2 氨基酸序列同源性比較 將推導的氨基酸序列與廣西野毒株和疫苗株的氨基酸序列進行同源性比較，NN1107株與廣西vvIBDV毒株的同源性在94.9%～99.4%之間，其中與野毒株 BH09、NNTZ（3）、NN07122和 HP1001的同源性最高，為99.4%。NN1107株與廣西cIBDV毒株的同源性在91.1%～93%之間；而與疫苗株的同源性在91.8%～97.5%之間，其中與 B87（in）、Bursine－2、FW2512株的同源性均為91.8%；與 B87（BJ）和MB株的同源性則為93%和97.5%。

2.2.3 氨基酸序列分析 NN1107株vVP2氨基酸序列中與病毒毒力和抗原相關(guān)的氨基酸均符合vvIBDV 特 征[13－14]，即第326～332位的七肽區(qū)SWSASGS序列保持不變；大親水一區(qū)（第212～224位氨基酸）內(nèi)212、213、214和222位氨基酸為N、D、Y和A；大親水二區(qū)（第314～324位氨基酸）內(nèi)318、321、323和324位氨基酸為G、G、D和Q；小親水一區(qū)（第248～252位氨基酸）內(nèi)249位氨基酸為Q；小親水二區(qū)（第279～290位氨基酸）279和284位氨基酸為D和T。其他與病毒毒力和抗原相關(guān)的氨基酸位點，如第242、253、254、256、270、294、299和330位氨基酸分別為I、Q、G、I、A、I、S和S。NN1107株與廣西部分野毒株和疫苗株的vVP2氨基酸序列比較見圖1。

圖1 vVP2的氨基酸序列比較Fig.1 Comparison of the amino acid sequences of vVP2

2.3 分離株vVP2序列的遺傳進化分析

將NN1107株與5株IBDV疫苗株和26株2000年—2010年在廣西流行的IBDV野毒株的vVP2核苷酸序列進行同源性比較，繪制遺傳進化樹（圖2）?？梢园l(fā)現(xiàn)遺傳進化樹由vvIBDV毒株、cIBDV毒株和疫苗株3個群組成，群間的親緣關(guān)系較遠。NN1001株屬于vvIBDV毒株群，它與曾經(jīng)在2004年、2005年、2007年和2010年流行的毒株BH09、NNTZ（3）、NN07122、HP1001的親緣關(guān)系最近，共同組成亞群2；而2006年、2007年和2010年的大部分毒株以及2004年至2005年流行的大部分毒株分別組成亞群1和亞群3。

圖2 根據(jù)vVP2核苷酸序列繪制的遺傳進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of isolate and reference strains based on the nucleotide sequences of vVP2

3 討論

采用雞胚絨毛尿囊膜接種和RT－PCR檢測技術(shù)對臨床疑似IBD的病死雞法氏囊進行IBDV的分離和鑒定，成功分離出一株IBDV（NN1107株）。對NN1107分離株vVP2片段進行克隆和測序，序列分析和同源性比較結(jié)果顯示，NN1107株具有vvIBDV的特征性酶切位點SspI，且與廣西vvIBDV野毒株的同源性極高，表明NN1107株為一株vvIBDV。

VP2蛋白不僅是IBDV的一個主要結(jié)構(gòu)蛋白，誘導機體產(chǎn)生保護性中和抗體，還是一個變異最大的蛋白，其變異主要集中在vVP2區(qū)域（第206～350位氨基酸），vVP2內(nèi)氨基酸的改變都有可能使病毒的毒力增強，突破疫苗的免疫保護[7－9]。因此，可以通過vVP2序列的同源性比較來分析毒株的遺傳進化。vVP2氨基酸序列同源性比較和遺傳進化分析顯示，在近10年，廣西同時存在著cIBDV和vvIBDV兩種不同毒力的IBDV毒株流行。本研究分析的27株IBDV毒株中，只有7株毒株屬于cIBDV，且毒株大都分離于2005年以前，只有1株BB0901是分離于2009年；而vvIBDV毒株分離自2004年至2011年，表明廣西目前IBDV的主要流行毒株仍然為vvIBDV。

NN1107株與2004年毒株BH09、2005年毒株NNTZ（3）、2007年毒株 NN07122和2010年毒株HP1001的同源性高達99.4%；其主要氨基酸位點也未發(fā)生任何改變，說明這些毒株很有可能來源于同一病毒株的進化。本研究構(gòu)建的遺傳進化樹也顯示vvIBDV在進化中也分成2個亞群，在同一地區(qū)，如位于桂南地區(qū)的南寧市和位于桂北地區(qū)的桂林市都存在有不同亞群的vvIBDV，表明廣西vvIBDV來源復雜，流行不受地域限制。

從vVP2核苷酸序列繪制的遺傳進化樹可以看出，NN1107株等vvIBDV毒株與傳統(tǒng)的疫苗株B87（in）、Bursine－2、FW2512株分屬于兩個基因群。在與病毒毒力和抗原相關(guān)的氨基酸位點中，有10個位點，即第212、222、249、256、270、279、284、286、294和299位的氨基酸發(fā)生了改變。這些氨基酸的改變可能會導致中和抗體識別的抗原表位發(fā)生構(gòu)象上的變化，使疫苗株 B87（in）、Bursine－2、FW2512株誘導機體產(chǎn)生的中和抗體不能有效地與病毒結(jié)合，阻斷vvIBDV感染B淋巴細胞，這可能是vvIBDV突破高水平母源抗體保護的原因。

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