王楊科，路宏朝，王 琦

（陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000）

鎘（cadmium，Cd）廣泛分布于自然界中，是世界自然基金會(huì)（World wide fund for nature，WWF）確認(rèn)的水生生態(tài)環(huán)境中最重要的重金屬污染物[1－2]。具有污染范圍廣、持續(xù)時(shí)間長、毒性強(qiáng)、難以降解以及能沿食物鏈轉(zhuǎn)移富集、污染后不易被發(fā)現(xiàn)等特點(diǎn)，對水生生物和人體產(chǎn)生嚴(yán)重的危害[3－5]。低濃度的鎘對魚類產(chǎn)生較強(qiáng)的毒性效應(yīng)，導(dǎo)致各組織器官如鰓、肝、腎、腦等出現(xiàn)廣泛的損害，引起生長和繁殖異常，甚至死亡[6]。有研究顯示，肝臟是體內(nèi)最初鎘積累和產(chǎn)生毒性的主要部位[7]。

泥鰍（Misgurnus anguillicadatus）是一種良好的土壤與水域環(huán)境污染的監(jiān)測動(dòng)物，屬鯉形目（Cypriniformes），鰍科（Cobitidae）泥鰍屬，分布極為廣泛，取材方便，不受季節(jié)限制，抗病能力較強(qiáng)，食性廣。因此，近年來常被用來檢測水體的污染情況，評價(jià)污染物對水生生物的遺傳損害及毒理效應(yīng)等[8－9]。本研究以泥鰍為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，采用生物毒性試驗(yàn)，研究鎘對泥鰍肝臟的損傷和過氧化氫酶活性的影響，從而探討鎘對魚類的毒害機(jī)制，間接檢測環(huán)境的污染情況，并對泥鰍的抗逆機(jī)制作初步研究，為發(fā)展?jié)O業(yè)生產(chǎn)和水體中金屬污染防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物 泥鰍購自陜西省漢中市水產(chǎn)市場，體長13.0cm±1.8cm，體重13.4g±1.4g。動(dòng)物在曝氣2d的自來水中暫養(yǎng)5d后，挑選體格健壯、體表無損傷、個(gè)體差異較小的泥鰍作為試驗(yàn)?zāi)圉q。

1.1.2 試劑和儀器 氯化鎘（CdCl2·2.5H2O，分析純），天津市蘇莊化學(xué)試劑廠產(chǎn)品；其它試劑均為化學(xué)分析純試劑。生物研究顯微鏡（E600），尼康公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 染毒 采用靜水養(yǎng)殖法[4]，根據(jù)國家漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（Cd2＋：≤0.005mg／L），并結(jié)合文獻(xiàn)[5]，設(shè)置0.05、0.5、5.0mg／L 3個(gè)濃度的Cd2＋染毒組，以曝氣2d以上自來水為陰性對照組，每組取12尾，試驗(yàn)設(shè)立兩個(gè)平行試驗(yàn)組。每組的染毒溶液15L，染毒時(shí)間分別為2、4、6、8、10d。

1.2.2 制作肝組織石蠟切片 染毒6d后，迅速采集肝組織，石蠟包埋，HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察[6]。

1.2.3 過氧化氫酶活性 參照文獻(xiàn)[7]，用濾紙吸干肝臟、稱重，加入4℃的0.25mol／L蔗糖溶液10 mL／g，勻漿，以1500r／min離心5min，取上清液，用0.25mol／L蔗糖溶液將其稀釋20倍，置于4℃待測。采用硫代硫酸鈉（Na2S2O3）滴定法測定過氧化氫酶活性，各染毒組、對照組均加入0.01mol／L（pH6.8）H2O2磷酸緩沖液5mL；于25℃水浴中恒溫1min；染毒組加入酶液1mL，對照組加1mL純凈水，混勻，25℃水浴中保溫3min；加入0.5mol／L H2SO4溶液2mL，100g／L KI溶液0.5mL，10 g／L（NH4）2MoO4溶液1滴；混勻靜置3min，用0.005mol／L Na2S2O3溶液滴定，達(dá)淺黃色時(shí)，加淀粉指示劑3滴，至藍(lán)色消失，記錄消耗的Na2S2O3溶液數(shù)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 原始數(shù)據(jù)通過SPSS11.0軟件中的ANOVA程序處理。

2 結(jié)果

2.1 大體病理變化

染毒6d后，肉眼觀察較高濃度染毒組（Cd2＋：0.5、5mg／L）泥鰍脊椎出現(xiàn)彎曲（圖1），體表有紅色出血點(diǎn)（圖2）；解剖后發(fā)現(xiàn)，體腔內(nèi)有大量的淡黃色液體滲出，肝（胰）臟和膽囊充盈腫大。

圖1 脊椎彎曲、畸形Fig.1 Antisternum bend and malformaction

圖2 體表出現(xiàn)血點(diǎn)Fig.2 Hemorrhage in body surface

2.2 肝臟病理組織學(xué)變化

泥鰍經(jīng)不同濃度Cd2＋暴露染毒后，隨著染毒時(shí)間的延長，較高濃度染毒組（0.5、5mg／L）與對照組相比，肝組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常變化（圖3，圖4）。主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞腫脹，出現(xiàn)破裂現(xiàn)象，肝索間隙增大，部分細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)小空泡，呈蜂窩狀，核被擠向一側(cè)（圖5）；肝細(xì)胞條索狀消失，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)較大的空泡，核懸浮在細(xì)胞的中央，細(xì)胞破裂，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞核出現(xiàn)濃縮、破裂、溶解，甚至消失（圖6）。

2.3 過氧化氫酶活性的變化

隨著鎘染毒濃度的增加和同一濃度處理時(shí)間的延長，滴定所消耗的硫代硫酸鈉量顯著下降。染毒2d后，染毒組與對照組之間無顯著差異（P＞0.05）；染毒4d后，0.05mg／L染毒組與對照組之間差異顯著（P＜0.05），其余兩染毒組與對照組相比差異極顯著（P ＜0.01）；染毒6、8、10d后，染毒組與對照組之間相比都差異極顯著（P＜0.01）（表1）。

圖3 對照組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常（HE400×）Fig.3 Normal hepatic cell structure in control group（400×）

圖4 0.05mg／L染毒組肝索較明顯，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整（HE400×）Fig.4 Hepatic cord is more obvious and cell structure is complete in contaminated group of 0.05mg／L（400×）

圖5 0.5mg／L染毒組肝細(xì)胞彌散、破碎（HE400×）Fig.5 Hepatic cells are confused and broken in contaminated group of 0.5mg／L（400×）

圖6 5mg／L染毒組肝細(xì)胞破裂，溶解（HE400×）Fig.6 Hepatic cells are ruptured and dissoved in contaminated group of 0.5mg／L（400×）

表1 鎘對泥鰍過氧化氫酶活性的影響Table1 Effects of Cd2＋on liver catalase activity in loach

3 討論

細(xì)胞內(nèi)的鎘能取代鈣與肌動(dòng)蛋白、微管、微絲相結(jié)合，從而破壞細(xì)胞骨架的完整，損害細(xì)胞的功能；鎘還能破壞細(xì)胞之間的連接。鎘與磷質(zhì)（骨質(zhì)磷酸鈣）發(fā)生親和反應(yīng)，將骨質(zhì)磷酸鈣中的鈣置換出來，使骨骼嚴(yán)重缺鈣而變得疏松、軟化，繼而發(fā)生萎縮、變形和骨折等[10]。本次研究發(fā)現(xiàn)，鎘染毒組（0.5 mg／L、5mg／L）泥鰍在染毒6d后脊椎出現(xiàn)了彎曲，說明是由于鈣的嚴(yán)重缺失才導(dǎo)致脊椎的變形。體表的紅色出血點(diǎn)，可能是由于水環(huán)境中的鎘被魚體吸收后進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，一方面改變血管的通透性，使血管壁損傷，引起出血，另一方面導(dǎo)致血紅蛋白降解產(chǎn)生大量血源性色素（含鐵血黃素）所致[11]。

在環(huán)境脅迫等逆境情況下，生物體內(nèi)廣泛存在活性氧曝發(fā)現(xiàn)象，導(dǎo)致自由基增多，使細(xì)胞膜產(chǎn)生過氧化，引起細(xì)胞膜的破壞和損傷。過氧化氫酶在清除超氧自由基、H2O2和過氧化物及阻止或減少羥基自由基形成等方面發(fā)揮重要作用[12]。本試驗(yàn)中，隨著染毒濃度的增加和同一濃度處理時(shí)間的延長，硫代硫酸鈉所消耗的量越來越少，表明肝組織中過氧化氫酶的催化能力越來越弱，即Cd2＋對過氧化氫酶的活性抑制作用越來越大。結(jié)合肝臟顯微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Cd2＋的染毒劑量達(dá)到0.5mg／L時(shí)泥鰍肝臟出現(xiàn)了損傷，濃度越大肝損傷越嚴(yán)重。

綜上所述，泥鰍對Cd2＋反應(yīng)較為靈敏，能反映水體中污染物的作用，是一種較有前途的生物檢測指標(biāo)和生物標(biāo)志物。

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