王英妹 鄭海峰 武鐵軍 李慶祥 張健

黃芩苷(baicalin)是從唇形科植物黃芩中提取、分離出來的黃酮類化合物，是黃芩的主要有效成分之一，具有多種藥理作用，如:抗菌、抗氧化、誘導(dǎo)干細(xì)胞分化等［1－3］。研究表明，黃芩苷具有抗腫瘤的作用，但對其具體的作用機(jī)制目前尚未明了［1］。肺腺癌是臨床常見的惡性腫瘤之一。隨著我國工業(yè)化進(jìn)程，肺腺癌發(fā)病和病死率目前均居惡性腫瘤前列，對人民健康危害極大。手術(shù)和化學(xué)治療在肺腺癌治療中占有很重要的地位，但存在一定的局限性和不良反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)探討了baicalin對人肺腺癌細(xì)胞A549侵襲遷移的影響，并檢測了與腫瘤侵襲遷移關(guān)系密切的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2、MMP-9、細(xì)胞間黏附分子(intercellular adhesion molecule，ICAM)-1在用藥前后表達(dá)的變化，為baicalin應(yīng)用于肺腺癌的臨床治療提供一些新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株:A549肺腺癌細(xì)胞株，購自中科院上海細(xì)胞研究所。

1.1.2 藥物:Baicalin購自南京青澤醫(yī)藥公司，純度:99.1%。

1.1.3 主要試劑:Trizol試劑為美國 Invitrogen公司產(chǎn)品，RTPCR試劑盒購自 Promega公司;MMP-2、MMP-9、ICAM-1、GAPDH引物由上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞劃痕試驗(yàn):將肺腺癌A549細(xì)胞株傳代于玻片上，生長至100%匯合后，用無菌吸頭在玻片上劃痕。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗凈被刮下的細(xì)胞，每孔加纖連蛋白后分別加入0、0.5、1、2、4、8 mg/L baicalin，對照組加等量 0.5% 二甲基亞砜(DMSO)，孵育48 h，取出玻片，低倍視野下觀察細(xì)胞傷口愈合情況。隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞的數(shù)量，以此表示細(xì)胞的遷移活性。實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次。計(jì)算:細(xì)胞遷移抑制率(%)=(1試驗(yàn)組遷移細(xì)胞數(shù)/對照組遷移細(xì)胞數(shù))×100%。

1.2.2 Transwell小室侵襲試驗(yàn):采用24孔板Transwell小室進(jìn)行，包被有膠原基質(zhì)的Millipore濾膜孔徑為8 m。分別將0、0.5、1、2、4、8 mg/L baicalin 處理的肺腺癌 A549 細(xì)胞株用0.25%胰蛋白酶消化后，以105個(gè)/孔接種于上層小室，下層小室加入10%胎牛血清(FBS)培養(yǎng)液，37℃孵育16 h，取出濾膜用棉拭子輕輕擦掉濾膜上層的細(xì)胞，置于中甲醇固定10 min，高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)遷移至濾膜下層的細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。抑制率(%)=(1試驗(yàn)組侵襲細(xì)胞的數(shù)量/對照組侵襲細(xì)胞的數(shù)量)×100%。

1.2.3RT-PCR方法測定:MMP-2、MMP-9及 ICAM-1 mRNA 的表達(dá)2 mg/L baicalin處理肺腺癌A549細(xì)胞株48 h，收集細(xì)胞，Trizol一步法提取總RNA，按試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR，擴(kuò)增目的片段。設(shè)定PCR反應(yīng)條件:95℃、5 min;然后，95℃ 30 s、58℃ 20 s、72℃ 30 s，進(jìn)行 25 個(gè)循環(huán)，72℃ 延伸10 min。PCR片段經(jīng)2%瓊脂糖電泳分離，凝膠成像儀掃描成像，并進(jìn)行光密度分析。GAPDH基因作為內(nèi)參照。各目的基因擴(kuò)增片段光密度值/內(nèi)參照密度值，將此比值進(jìn)行比較。所用引物序列見表1。

表1 PCR所用引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，進(jìn)行ANOVA分析處理和Dunnett檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度baicalin對肺腺癌A549細(xì)胞株遷移侵襲能力的影響 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，0.5、1、2、4、8 mg/L baicalin 作用于肺腺癌A549細(xì)胞株后，對肺腺癌A549細(xì)胞株平面遷移活性均有不同程度的抑制作用，抑制率分別為(9.1±1.6)%、(19.4±3.1)%、(42.7 ± 6.4)%、(47.6 ± 6.9)%、(49.3 ± 7.7)%。Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，0.5、1、2、4、8 mg/L baicalin 作用于肺腺癌A549細(xì)胞株后16 h，細(xì)胞跨膜遷移活性的抑制率分別為(8.5 ±1.3)%、(17.4 ±2.9)%、(40.1 ±6.5)%、(45.5±6.9)%、(48.8 ±7.3)%。

2.2 Baicalin對人肺腺癌細(xì)胞株 A549 MMP-2、MMP-9及ICAM-1 mRNA表達(dá)的影響 RT-RCR結(jié)果顯示，與對照組相比，2 mg/L baicalin處理人肺腺癌細(xì)胞株A549 48 h后，MMP-2、MMP-9、ICAM-1 mRNA表達(dá)明顯降低(P＜0.01)。見表 2、圖1。

表2 Baicalin對A549細(xì)胞MMP-2、MMP-9及ICAM-1 mRNA表達(dá)的影響n=3，±s

表2 Baicalin對A549細(xì)胞MMP-2、MMP-9及ICAM-1 mRNA表達(dá)的影響n=3，±s

注:與對照組比較，*P ＜0.01

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圖1 Baicalin對A549細(xì)胞MMP-2、MMP-9及ICAM-1 mRNA表達(dá)的影響

3 討論

肺腺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率居各惡性腫瘤前列，同時(shí)，由于該病起病隱匿、缺乏典型癥狀，大部分病例就診時(shí)已處于中晚期，5年生存率僅約10%。目前主要治療方法是手術(shù)治療結(jié)合放射治療和化學(xué)治療等，化療在其中發(fā)揮重要作用，但化療藥物因殺瘤效果不理想且存在較大的不良反應(yīng)導(dǎo)致臨床應(yīng)用療效不佳。因此，如何尋找療效明確、不良反應(yīng)小的藥物對臨床肺腺癌治療的意義重大，新型中藥開發(fā)已成為肺癌治療研究的熱點(diǎn)。中醫(yī)認(rèn)為，肺癌發(fā)生是由于人體正氣虛弱又毒邪襲肺、或痰濕凝聚于肺，致機(jī)體陰陽失調(diào)，邪阻于肺而成積。黃芩苷為傳統(tǒng)中藥黃芩的主要有效成分之一，主要功效為清熱燥濕、瀉火解毒，已有報(bào)道黃芩苷能抑制人肝癌細(xì)胞的侵襲能力［4］，本實(shí)驗(yàn)探討黃芩苷對肺腺癌A549細(xì)胞的侵襲遷移的影響及可能機(jī)制，為肺腺癌的綜合治療和新型中藥開發(fā)提供依據(jù)。

肺癌細(xì)胞的侵襲遷移能力的強(qiáng)弱是導(dǎo)致腫瘤惡性程度高低的基本原因，臨床絕大多數(shù)肺癌患者死于腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。因此本研究以細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測了baicalin對肺癌細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果顯示，各濃度baicalin對肺腺癌細(xì)胞的遷移均有抑制作用，提示baicalin可能通過抑制細(xì)胞瘤細(xì)胞的游走而抑制肺癌進(jìn)展;同時(shí)本研究以Transwell小室實(shí)驗(yàn)評價(jià)了baicalin對肺癌細(xì)胞瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響，結(jié)果同樣提示顯示baicalin可明顯抑制肺腺癌腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，說明baicalin對肺癌細(xì)胞的侵襲遷移能力有良好的抑制作用。但本研究僅為起步階段，需要進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)深入研究。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)對基底膜中細(xì)胞外基質(zhì)的降解是腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的重要步驟之一［5，6］。MMPs家族是一類內(nèi)源性蛋白水解酶，MMP-2和MMP-9即為該家族的重要成員，這兩種酶的主要功能為降解明膠和Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型基底膜膠原，在細(xì)胞與基質(zhì)間的黏附中起著重要的作用，MMP-2、MMP-9的表達(dá)與腫瘤侵襲關(guān)系密切。有研究顯示，在肺癌細(xì)胞中，MMP-2、MMP-9高表達(dá)可促進(jìn)該腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移［7］。本研究以baicalin作用于肺腺癌腫瘤細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)處理組腫瘤細(xì)胞 MMP-2、MMP-9 mRNA水平明顯低于對照組，表明baicalin可通過下調(diào)MMP-2、MMP-9的表達(dá)起到抗肺癌的作用。細(xì)胞間黏附因子-1(ICAM-1)可促進(jìn)細(xì)胞間黏附作用加強(qiáng)，在腫瘤免疫中起重要作用，可以促進(jìn)腫瘤的侵襲進(jìn)展［8］，也有研究報(bào)道ICAM-1與肺癌侵襲關(guān)系密切［9］。本研究顯示，baicalin作用于肺癌細(xì)胞后可抑制ICAM-1的表達(dá)，說明這可能也是baicalin抑制肺癌細(xì)胞侵襲的機(jī)制之一。

本研究發(fā)現(xiàn)baicalin對肺癌細(xì)胞的侵襲遷移能力有良好的抑制作用，值得進(jìn)一步研究并進(jìn)行臨床試驗(yàn)。但本研究尚處于初級階段，研究還欠深入，需全面分析baicalin的抗肺癌機(jī)制，以期為肺癌綜合治療做出貢獻(xiàn)。

1 Zhang S，Jin Y，Zhu W，et al.Baicalin released from scutellaria baicalensis induces autotoxicity and promotes soilborn pathogens.J Chem Ecol，2010，36:329-338.

2 Li CT，Zhang WP，F(xiàn)ang SH，et al.Baicalin attenuates oxygen-glucose deprivation-induced injury by inhibiting oxidative stress-mediated 5-lipoxygenase activation in PC12 cells.Acta Pharmacol Sin，2010，31:137-144.

3 Liang XL，Liao ZG，Zhu JY，et al.The absorption characterization effects and mechanism of Radix Angelicae dahuricae extracts on baicalin in Radix Scutellariae using in vivo and in vitro absorption models.J Ethnopharmacol，2012，139:52-57.

4 Chiu YW，Lin TH，Huang WS，et al.Baicalein inhibits the migration and invasive properties of human hepatoma cells.Toxicol Appl Pharmacol，2011，255:316-326.

5 Baek MJ.Prognostic Role of MMPs in colorectal cancer.J Korean Soc Coloproctol，2011，27:105-106.

6 Roomi MW，Monterrey JC，Kalinovsky T，et al.Inhibition of invasion and MMPs by a nutrient mixture in human cancer cell lines:a correlation study.Exp Oncol，2010，32:243-248.

7 Gao M，Zhang JH，Zhou FX，et al.Angelica sinensis suppresses human lung adenocarcinoma A549 cell metastasis by regulating MMPs/TIMPs and TGF-β1.Oncol Rep，2012，27:585-593.

8 Wang QL，Li BH，Liu B，et al.Polymorphisms of the ICAM-1 exon 6(E469K)are associated with differentiation of colorectal cancer.J Exp Clin Cancer Res，2009，28:139.

9 Guney N，Soydinc HO，Derin D，et al.Serum levels of intercellular adhesion molecule ICAM-1 and E-selectin in advanced stage non-small cell lung cancer.Med Oncol，2008，25:194-200.