高峰 楊季紅 劉渤 劉玉英 馬芳

肝癌是世界范圍內(nèi)高發(fā)腫瘤，因其侵襲轉(zhuǎn)移性強(qiáng)而成為臨床治療的難點(diǎn)，因此尋找肝癌治療中的靶分子指標(biāo)顯得尤為重要。近年NDRG1基因表達(dá)與腫瘤生物學(xué)特性的關(guān)系備受關(guān)注，有研究發(fā)現(xiàn)NDRG1在肝細(xì)胞癌、結(jié)腸癌［1，2］等多種人類腫瘤中高表達(dá)，據(jù)此認(rèn)為NDRG1作為癌基因參與并促進(jìn)了腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程。但也有相反觀點(diǎn)認(rèn)為NDRG1是一種與細(xì)胞分化程度呈正相關(guān)的抑癌基因［3］。乙酰肝素酶(Hpa)是一種在多種惡性腫瘤中高表達(dá)且與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移有極高相關(guān)性的葡萄糖醛酸內(nèi)切酶［4］。關(guān)于NDRG1和Hpa異常表達(dá)與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究文獻(xiàn)未見(jiàn)報(bào)道，本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法聯(lián)合檢測(cè)NDRG1和Hpa在肝癌中的表達(dá)，探討二者在肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究中46例經(jīng)病理證實(shí)的肝癌組織和12例肝血管瘤等正常肝組織取自本院2007年7月至2011年6月手術(shù)切除標(biāo)本，所有患者術(shù)前均未經(jīng)過(guò)放、化療及免疫治療。46例肝癌患者中，男30例，女16例;年齡28～69歲，平均年齡46歲;按照Edmonson病理學(xué)分級(jí)，Ⅰ、Ⅱ級(jí)26例，Ⅲ、Ⅳ級(jí)20例。癌旁組織均取自距腫瘤邊緣1～2 cm的非肝癌組織。正常肝組織為同期手術(shù)治療的肝臟良性疾病，其中肝血管瘤4例，肝囊腫3例，肝外傷5例。標(biāo)本經(jīng)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋保存。

1.2 主要試劑 羊抗人NDRG1(N-19)多克隆抗體為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品，兔抗人Hpa多克隆抗體為美國(guó)LAB VISION公司產(chǎn)品，PV-9003、PV-9001超敏即用型二步法(非生物素)檢測(cè)試劑盒為美國(guó)GBI公司產(chǎn)品，濃縮型二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒等購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色 將石蠟組織塊以4 μm厚度連續(xù)切片，分別做HE和免疫組織化學(xué)染色，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化;3%過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶15 min。NDRG1抗原修復(fù)采用檸檬酸抗原修復(fù)液(0.01 mol/L，pH=6.0)、高壓熱修復(fù)。Hpa行磷酸鹽緩沖液(PBS)微波修復(fù)抗原。分別滴加羊抗人NDRG1(N-19)多克隆抗體(1∶100)，兔抗人Hpa多克隆抗體(1∶50)，4℃過(guò)夜。滴加二步法檢測(cè)試劑(按照說(shuō)明書操作)，DAB顯色。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性組織作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷 NDRG1陽(yáng)性染色位于細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞膜，Hpa陽(yáng)性染色主要分布于細(xì)胞質(zhì)。二者陽(yáng)性信號(hào)均為黃-棕黃色顆粒，小片狀或彌漫性分布。高倍鏡下隨機(jī)觀察10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，按照陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比與著色強(qiáng)度采用雙評(píng)分半定量法進(jìn)行評(píng)分。(1)陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):陽(yáng)性細(xì)胞＜25%為0分，25% ～50%為1分，51% ～75%為2分，＞75%為3分。(2)著色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):不著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。取(1)(2)項(xiàng)評(píng)分相加，0～1分為陰性(－)，2分為弱陽(yáng)性(+)，3～4分為陽(yáng)性(++)，5～6分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件，應(yīng)用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)對(duì)NDRG1，Hpa在肝癌組織、癌旁組織及正常肝組織中的表達(dá)結(jié)果進(jìn)行分析，應(yīng)用Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)對(duì)NDRG1，Hpa表達(dá)之間及與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性進(jìn)行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NDRG1與Hpa在肝癌、癌旁及正常肝組織中的表達(dá)

NDRG1與Hpa蛋白在肝癌組織中的表達(dá)水平顯著高于其對(duì)應(yīng)的癌旁組織及正常肝組織(P＜0.01);NDRG1與Hpa蛋白在癌旁組織和正常肝組織中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表 1，圖 1、2。

圖1 肝癌組織中NDRG1蛋白的表達(dá)(SP×400)

圖2 肝癌組織中Hpa蛋白的表達(dá)(SP×400)

表1 NDRG1和Hpa在肝癌、癌旁、正常肝組織中的表達(dá)例

2.2 NDRG1與Hpa的表達(dá)與肝癌臨床病理特征的關(guān)系

NDRG1蛋白表達(dá)水平與門靜脈有無(wú)癌栓，肝內(nèi)或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。HPA蛋白表達(dá)水平與腫瘤大小、有無(wú)肝內(nèi)或淋巴轉(zhuǎn)移以及肝癌組織分化程度間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2 NDRG1與HPA在肝癌組織中的表達(dá)與肝癌臨床病理因素的關(guān)系 例

2.3 NDRG1與Hpa在肝癌組織中表達(dá)的相關(guān)性 在HCC組織中NDRG1與Hpa的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.617，P＜0.01)。見(jiàn)表3。

表3 HCC組織中NDRG1和HPA的關(guān)系 例

3 討論

NDRG家族是近年才被逐漸發(fā)現(xiàn)的一族與細(xì)胞分化相關(guān)的新基因［5］。NDRG1最初是在小鼠胚胎組織中發(fā)現(xiàn)的，因受N-myc的抑制而得名，該基因與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系密切，但其對(duì)腫瘤是否具有抑制或促進(jìn)作用仍存在爭(zhēng)論［2，6，7］。以往關(guān)于NDRG1在腫瘤組織中表達(dá)情況的研究主要集中在前列腺癌、結(jié)直腸癌及腦膠質(zhì)瘤等，且研究結(jié)果有較大差異［3］。最初研究發(fā)現(xiàn)，NDRG1在前列腺癌、結(jié)腸癌中低表達(dá)，而在體外誘導(dǎo)分化的結(jié)腸癌細(xì)胞中高表達(dá)，因而推斷其可能是一種與細(xì)胞分化程度呈正相關(guān)的抑癌基因［3］。但 Koshiji等［2］研究顯示NDRG1在結(jié)直腸癌中表達(dá)明顯增加，視不同種族結(jié)直腸癌患者，NDRG1蛋白表達(dá)和組織病理類型、Duke’s分級(jí)、淋巴管或靜脈浸潤(rùn)等臨床病理特征明顯相關(guān)。另有報(bào)道，NDRG1蛋白在惡性黑色素瘤、腦瘤、腎癌、肺癌等多種惡性腫瘤組織中高表達(dá)，而在正常組織中低表達(dá)，認(rèn)為可以把NDRG1蛋白作為一種新的檢測(cè)惡性腫瘤的標(biāo)志物［8］。檢索文獻(xiàn)，關(guān)于NDRG1基因與肝細(xì)胞癌的關(guān)系的研究報(bào)道較少。何靜等［9］檢測(cè)了NDRG1在肝癌和配對(duì)的癌旁組織、正常肝組織、人胎肝組織及胚胎各組織、發(fā)育不同時(shí)期小鼠肝和以及多種細(xì)胞系中的表達(dá)譜，結(jié)果表明NDRG1在正常肝組織和癌旁組織中表達(dá)量顯著低于肝癌組織中的表達(dá)量，而正常肝組織和癌旁組織表達(dá)量差異不明顯，NDRG1的表達(dá)量隨人胎肝和嬰鼠肝的逐漸發(fā)育而增高，至已達(dá)分化的成年肝又轉(zhuǎn)而降低，提示NDRG1可能是一種在細(xì)胞分化的一定階段呈高表達(dá)的與細(xì)胞分化相關(guān)的基因。本研究結(jié)果表明，NDRG1蛋白在肝癌組織中的表達(dá)顯著高于其癌旁組織及正常肝組織(P＜0.01)，這與何靜等［9］的研究結(jié)果相一致，另外還發(fā)現(xiàn)，NDRG1蛋白表達(dá)水平與門靜脈有無(wú)癌栓，肝內(nèi)或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。這些結(jié)果提示NDRG1可能作為潛在的癌基因在肝細(xì)胞癌的發(fā)生及其演進(jìn)中起一定作用。有研究發(fā)現(xiàn)缺氧條件可誘導(dǎo)NDRG1基因在腫瘤組織中的高表達(dá)［10］，故而認(rèn)為NDRG1在腫瘤組織中高表達(dá)可能與實(shí)體腫瘤組織缺氧有關(guān)，但確切機(jī)制尚待繼續(xù)研究。

乙酰肝素酶(Hpa)是近年較受關(guān)注的具有促腫瘤作用的內(nèi)源性糖苷酶，通過(guò)對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)中硫酸肝素蛋白多糖側(cè)鏈的切割作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，還可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分裂、趨化、微血管形成。人類結(jié)腸癌的早期可以檢測(cè)到Hpa mRNA和蛋白聚集，而隨著病變進(jìn)展(重度不典型增生-高分化腺癌-低分化腺癌)Hpa水平逐漸增高，而在鄰近正常組織無(wú)表達(dá)［11］。研究發(fā)現(xiàn)，HPA在肝細(xì)胞癌中高表達(dá)，并與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［12］。Chen等［13］對(duì)120例原發(fā)性肝癌的研究發(fā)現(xiàn)，Hpa在腫瘤組織中顯著高表達(dá)，且與TNM分期、腫瘤大小、門靜脈癌栓或腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究中，Hpa蛋白在肝癌組織中的表達(dá)水平顯著高于其對(duì)應(yīng)的癌旁組織及正常肝組織，在癌旁組織和正常肝組織中的表達(dá)差異無(wú)顯著性。肝內(nèi)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均是反映腫瘤侵襲性的指標(biāo)，本研究還發(fā)現(xiàn)HPA的表達(dá)與腫瘤的大小和肝內(nèi)或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)，提示HPA對(duì)肝癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有重要的促進(jìn)作用。本研究還發(fā)現(xiàn)HPA與肝癌組織的分化程度相關(guān)，低分化的肝癌組織存在更高的HPA表達(dá)強(qiáng)度，說(shuō)明HPA在肝癌的病程演進(jìn)中起著一定作用。門靜脈癌栓亦能反映腫瘤的外侵能力，但在本研究中未發(fā)現(xiàn)HPA的表達(dá)與門靜脈癌栓相關(guān)，這與Chen等［13］的報(bào)道存在差異，可能與樣本例數(shù)偏少有關(guān)，尚有待于增加樣本量進(jìn)一步研究。

綜上所述，NDRG1、HPA在肝細(xì)胞癌組織中高表達(dá)，提示二者可能共同參與肝細(xì)胞癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，聯(lián)合檢測(cè)NDRG1、HPA有助于判斷肝細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移潛能和患者的預(yù)后，并可能為肝細(xì)胞癌的治療提供新的分子靶點(diǎn)和策略。

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