李水根 姚江武，2

（1.福建醫(yī)科大學口腔醫(yī)院 修復科，福州350002；2.廈門市口腔醫(yī)院 修復科，廈門361003）

在日常生活中，茶、紅酒和食用色素是天然牙最易接觸到的著色物。茶黃素（theaflavin，TF）、姜黃素（curcumin，Cur）和矢車菊素（cyanidin，Cy）是分別來自于茶葉、姜黃和葡萄的提取物，廣泛應用于食品添加劑中[1]。作為色源體的天然色素與人全唾液（whole saliva，WS）作用，可以沉積于牙面形成色漬，還可以與唾液蛋白結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)的活性，使口腔黏膜產(chǎn)生干燥和皺縮感[2]。表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）技術(shù)可以將蛋白質(zhì)分子自組裝于SPR傳感器芯片表面，特別適合于研究聚合物高分子與蛋白質(zhì)之間的相互作用。本研究利用SPR技術(shù)，將WS自組裝于芯片表面，考察色素TF、Cur和Cy吸附于WS表面的動態(tài)全過程，分析色素與WS蛋白質(zhì)分子之間的相互作用和親合力，探討物體表面著色物形成和干燥及皺縮感產(chǎn)生的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗儀器及試劑

SR7000DC型SPR儀（Reichert公司，美國）、Biofuge Fresco型低溫離心機（Heraeus公司，德國）、Millipore Direct-Q3超純水器（Millipore公司，法國）。高純度的TF、Cur和Cy，二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（日本西寶生物科技有限公司）。11-巰基十一烷酸（11-mercaptoundecanoic acid，11-MUA），1、3-二甲基氨基丙基-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽[1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）carbodiimide hydrochloride，EDC]，N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS），牛血清白蛋白，緩沖液（phosphate buffer solution，PBST）；上述試劑均為美國Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 WS的收集和蛋白質(zhì)量濃度的測定 收集WS的具體步驟詳見參考文獻[3]。收集完成后采用Bradford法測定WS蛋白的質(zhì)量濃度，測定步驟詳見參考文獻[4]。

1.2.2 自組裝WS膜 SPR芯片置于60 ℃的10 mmol·L-111-MUA/純乙醇溶液中24 h，取出后用純乙醇沖洗，氮氣吹干。通入1 mL的體積比為1∶1的0.2 mol·L-1EDC和0.1 mol·L-1NHS的混合溶液，活化SPR芯片10 min，然后注入1 mL的WS溶液至吸附達到穩(wěn)態(tài)，再注入1 mol·L-1pH8.5的乙醇胺鹽酸溶液1 mL，維持10 min，形成WS自組裝單分子膜（self-assembled monolayer，SAM）[5]。

1.2.3 SPR動態(tài)監(jiān)測 在25 ℃條件下，將色素溶解于pH值為6.8的DMSO中，并以10 mmol·L-1PBST稀釋成不同濃度（0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mmol·L-1）的溶液，以5 μL·min-1的流速分別注入芯片，30 min后色素吸附達到穩(wěn)態(tài)。實時記錄傳感圖譜。

1.2.4 吸附動力學公式 本研究選擇兩個吸附動力學公式，Langmuir公式[6]和Freundlich公式[7]，二者分別為C/M=1/KLMm+C/Mm和logM=logKf+1/n logC。式中C是被吸附溶液的濃度；M是吸附量；KL是Langmuir吸附常數(shù)，反映吸附過程的強度；Mm為飽和狀態(tài)的最大吸附量；1/n是常數(shù)；Kf是Freundlich吸附常數(shù)，意義同KL。以C/M對C和logM對logC作圖，求得直線的斜率和截距，進而求得吸附等溫線常數(shù)：KL、Mm和Kf。

SPR芯片上配體與分析物反應的速率公式[8]：dR/dt=kaCRmax-（kaC+kd）R。上式中C為分析物的濃度，Rmax為芯片上形成最多復合物時所得到的響應，R為在時間t時所得到的響應。以dR/dt對R作圖可得到一條直線，其斜率為表觀吸附常數(shù)Kobs，且Kobs=-（kaC+kd）。以-Kobs對C作圖，同樣可以得到一條直線，斜率即為結(jié)合速率常數(shù)ka，截距為解離速率常數(shù)kd。結(jié)合平衡常數(shù)KA=ka/kd，解離平衡常數(shù)KD=kd/ka[9]。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，對Langmuir和Freundlich吸附等溫線的相關(guān)決定系數(shù)（R2）進行配對t檢驗；采用單因素方差分析比較不同色素對WS的吸附動力學常數(shù)總體均數(shù)之間的差異，SNK-q檢驗用于均數(shù)間的兩兩比較，檢驗水準為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 WS蛋白的質(zhì)量濃度

采用Bradford法測定WS蛋白的質(zhì)量濃度的平均值為1.043 g·L-1。

2.2 吸附模型R2的比較

圖1為在25 ℃、pH值為6.8、10 mmol·L-1PBST的緩沖體系下，不同濃度的3種色素吸附于WS表面達到穩(wěn)態(tài)后所記錄的響應強度與時間的關(guān)系曲線。伴隨著色素濃度的增大，響應值不斷增大，提示吸附量不斷增多。圖2表示色素吸附于WS表面的Langmuir和Freundlich等溫線和表觀吸附常數(shù)Kobs與色素濃度的關(guān)系曲線。Langmuir模型下R2值為：TF為0.920 0±0.040 3、Cur為0.926 8±0.037 0、Cy為0.980 3±0.003 0；Freundlich模型下R2值為：TF為0.983 1±0.010 6、Cur為0.994 7±0.003 9、Cy為0.997 7±0.019 0。配對t檢驗結(jié)果為：兩種模型下，TF、Cur和Cy的R2值之間的差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖1 不同濃度的色素對WS生物膜表面吸附的響應強度與時間的關(guān)系曲線Fig 1 The curves of response versus time for the interactions of pigments with WS at various pigment concentrations

圖2 色素吸附于WS表面的動力學曲線Fig 2 The kinetic curves for pigments adsorption onto WS surface

2.3 吸附動力學常數(shù)的比較

根據(jù)圖2及吸附動力學公式求得常數(shù)KL、Mm和Kf及其統(tǒng)計學結(jié)果見表1。方差分析結(jié)果表明：KL值之間的差異不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示采用Langmuir模型采集的3種色素的吸附強度值相同；采用兩種模型采集的Mm和Kf值之間的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），即TF＞Cur＞Cy。

表1 3種色素的吸附動力學常數(shù)KL、 Mm和Kf的比較Tab 1 Comparison of adsorption kinetic constants KL,Mm and Kf for three kinds of pigments

2.4 速率常數(shù)和平衡常數(shù)的比較

速率常數(shù)和平衡常數(shù)的統(tǒng)計結(jié)果見表2：結(jié)合速率常數(shù)ka和結(jié)合平衡常數(shù)KA，其結(jié)果均為TF＞Cur＞Cy（P＜0.05），解離速率常數(shù)kd和解離平衡常數(shù)KD則是Cy＞Cur＞TF（P＜0.05），表明反應速率的變化趨勢與Freundlich模型采集的吸附強度和親和力趨勢一致。

表2 3種色素吸附于WS表面的速率常數(shù)和平衡常數(shù)的比較Tab 2 Comparison of constants of rate and equilibrium for three kinds of pigments

3 討論

3.1 唾液SAM

SAM是分子通過化學鍵相互作用自發(fā)吸附在固/液或氣/液界面，形成熱力學穩(wěn)定、能量最低的有序膜。在本實驗中，11-MUA末端的羧基在以EDC為催化劑的條件下與NHS反應，轉(zhuǎn)換為N-羥基琥珀酰亞胺酯，從而與唾液蛋白分子中的氨基反應形成共價鍵結(jié)合，將蛋白質(zhì)固定在固體表面。

3.2 吸附模型

本實驗中色素對WS膜的Langmuir和Freundlich等溫式的相關(guān)決定系數(shù)R2的配對t檢驗表明，F(xiàn)reundlich模型的R2值均大于Langmuir模型的R2值，且差異具有統(tǒng)計學意義，提示Freundlich模型更適合于描述本實驗的吸附反應。同時Langmuir模型的3種色素的吸附常數(shù)值（KL）相同，而Freundlich模型的吸附常數(shù)值（Kf）不相同，進一步表明吸附過程采用經(jīng)驗的Freundlich模型描述更為準確。

3.3 親和力

由表1可知，F(xiàn)reundlich模型中反映相互作用的親和力的動力學常數(shù)Kf值為TF＞Cur＞Cy，這表明茶黃素與唾液的親和力最強，姜黃素次之，矢車菊素最小。速率常數(shù)和平衡常數(shù)的統(tǒng)計結(jié)果表明：茶黃素吸附于唾液表面的速度最快，且達到平衡狀態(tài)的時間最短，姜黃素次之，矢車菊素最慢。色素吸附于唾液表面的親和力的結(jié)果與吸附等溫式的線性相關(guān)分析結(jié)果一致。在本研究中的3種酚式色素的分子結(jié)構(gòu)中，茶黃素芳香環(huán)上有9個-OH，姜黃素有3個-OH和2個甲氧基，矢車菊素有5個-OH。理論上甲氧基比-OH具有更強的極性，能夠在蛋白質(zhì)分子與酚式色素間形成羰氫鍵連接，進而具有親核加成能力[10]。由于姜黃素芳香環(huán)上的甲氧基的極性比矢車菊素分子結(jié)構(gòu)中-OH的略大，因此，姜黃素的穩(wěn)定性和生物活性強于矢車菊素，最終導致其在吸附反應中對唾液蛋白質(zhì)的親和力大于矢車菊素。當色素吸附于唾液蛋白質(zhì)分子的表面時，由于存在質(zhì)子轉(zhuǎn)移，酚式色素上的-OH與唾液蛋白分子上的H+結(jié)合位點發(fā)生氫鍵結(jié)合[11]。綜上所述，茶黃素芳香環(huán)上的-OH最多，故而生物活性最強，姜黃素次之，矢車菊素最弱。由此可見，酚式色素的生物活性隨著其分子結(jié)構(gòu)中羥基數(shù)量的增加而加強，這一結(jié)論與以往的研究結(jié)果相一致[12]。

本實驗通過對人唾液與色素之間的相互作用的動力學研究，建立了唾液和色素生物膜的體外分子模型，將色素吸附于唾液表面的研究深入到分子水平。動力學研究表明：唾液蛋白與色素之間的作用驅(qū)動力源自氫鍵反應。該模型的建立將有助于對牙著色機制進行深入研究，為預防牙著色的形成和改善牙的美觀以及了解口腔黏膜表面產(chǎn)生干燥和皺縮感的生理學機制奠定實驗依據(jù)。今后尚需在此動力學研究的基礎(chǔ)上，考察不同的生理條件（溫度、pH值和離子強度）下，色素對唾液蛋白構(gòu)象和生化特性的影響。

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