姚超 卜令學 王科 李寧毅 王玲玲 于躍遠

（青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院 口腔頜面外科，青島266003）

組織工程的迅速興起為頜骨缺損的修復提供了新的方法和思路。組織工程必須具備種子細胞、支架與生長因子[1]。通常將種子細胞植入多孔支架材料中，但普通用胰酶消化的細胞的Na+/K+-ATP酶、葡萄糖轉運蛋白-1（glucose transporter-1，GLUT-1）、鈉-葡萄糖共轉運載體-1（sodium glucose cotransporter-1，SGLT-1）、水通道蛋白等被破壞丟失，不利于其在支架上黏附、分泌細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）形成骨組織結構[2]。另外在植入過程中容易造成種子細胞丟失。筆者應用細胞片層技術獲取種子細胞，既保留了細胞間的結構，又保留了細胞分泌的ECM，減少了種子細胞的喪失[3]。本實驗在復合血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2）的聚乳酸羥基乙酸共聚物[poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA]支架材料中加入骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow stem cells，BMSCs）細胞懸液，并在其表面包裹犬BMSCs細胞片層，然后植入犬的下頜骨缺損處，以期構建具有一定正常骨結構和功能的組織工程骨，為下頜骨缺損探討更好的修復方法。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器設備

PLGA支架（山東省醫(yī)療器械研究所），DMEM培養(yǎng)液（Gibco公司，美國），rhBMP-2（Peprotech公司，美國），VEGF（Prospec公司，以色列），溫度反應性培養(yǎng)皿（Nunc公司，丹麥），倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本），JSM-840掃描電子顯微鏡（JEOL公司，日本）。

1.2 實驗動物

選取由青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院實驗動物中心提供的健康雜種犬16只為研究對象，12～14個月齡，體重18～23 kg，雌雄不限。由青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院實驗動物中心在相同條件下飼養(yǎng)。

1.3 方法

1.3.1 BMSCs的獲取、分離和培養(yǎng) 將實驗犬麻醉后抽取骨髓血10 mL，密度梯度離心法分離BMSCs。將BMSCs用培養(yǎng)液稀釋到密度為每毫升1×107個后，接種到50 mL培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察，達到80%匯合狀態(tài)時，采用0.25%胰蛋白酶（含0.02%乙二胺四乙酸）消化，以1∶2比例傳代。

1.3.2 BMSCs成骨誘導 將傳代培養(yǎng)的第二代細胞加入6 mL含10%胎牛血清、成骨誘導液[4]（50 mg·L-1維生素C、10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉、1×10-4mmol·L-1地塞米松）的DMEM高糖培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中，將BMSCs向成骨細胞誘導培養(yǎng)。

1.3.3 BMSCs細胞片層的制備 采用胰蛋白酶消化經(jīng)成骨誘導的BMSCs，在細胞計數(shù)后以每毫升1×107個的密度接種到溫度反應性培養(yǎng)皿中，放置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中，每3 d換液。10 d后BMSCs鋪滿培養(yǎng)皿底部，然后將培養(yǎng)皿放入20 ℃恒溫箱中30 min，BMSCs與溫度反應性培養(yǎng)皿底部分離形成細胞片層。

1.3.4 PLGA支架制備 將PLGA支架修整為上底長3 cm、寬1 cm；下底長2.5 cm、寬1 cm；高1 cm的多邊體，并在背側做一30 mm×3 mm×5 mm凹槽，以備嵌入下牙槽神經(jīng)血管束。利用冷凍真空干燥法將0.1 μg·mL-1rhBMP-2和5 μg·mL-1VEGF復合到PLGA支架中，低溫消毒后，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 BMSCs接種和細胞片層包裹支架 將誘導后的BMSCs用0.25%胰酶消化，加入培養(yǎng)液終止消化后，1 000 r·min-1離心5 min，調(diào)整細胞密度，以細胞密度為每毫升1×107個植入到PLGA支架中，使支架完全浸濕，分為A、B組。A組在支架表面包裹2層BMSCs細胞片層，作為實驗組；B組不包裹BMSCs細胞片層，作為對照組。置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，取部分掃描電鏡觀察。

1.3.6 動物體內(nèi)植入 將16只犬分為4組，每組4只，靜脈麻醉成功后，在兩側下頜骨體下緣各做5 cm切口，切開皮膚、筋膜及肌肉，暴露下頜骨體，在兩側下頜骨體中部各做一與支架相對應的上寬下窄全層梯形缺損，以防植入體脫出，注意保留下牙槽神經(jīng)血管束。左側（實驗側）植入支架A，右側（對照側）植入支架B。將下頜神經(jīng)血管束嵌入支架凹槽中，嚴密縫合軟組織，對支架進一步固定。術后每只實驗犬每天肌注青霉素400萬U，持續(xù)7 d。

1.3.7 大體觀察、影像學檢查和組織學檢查 術后4、8、12、16周分別處死1組實驗動物，取出雙側下頜骨作大體觀察。在同樣投照條件下（電壓：51 kV，電流：4.13 mA，時間：0.04 s，投照距離：1 m）拍攝標本X線片，用image pro plus 6.0軟件分析測量光密度值。實驗側與對照側在相同部位分別切取部分標本組織，常規(guī)脫礦，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，制作組織切片，倒置相差顯微鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，對不同組同一時間點光密度值采用配對t檢驗，對同一組不同時間點光密度值采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 細胞培養(yǎng)

BMSCs接種后4 h可觀察到少量細胞貼壁；接種后24 h，細胞呈不規(guī)則三角形。接種后10 d，細胞達到100%匯合狀態(tài)，并呈長梭形或旋渦狀排列（圖1）。向成骨方向誘導后，細胞逐漸變圓，排列緊密，部分細胞重疊（圖2）。

2.2 BMSCs細胞片層收獲

將誘導后的BMSCs接種到溫度反應性培養(yǎng)皿中，7～10 d后可見細胞鋪滿培養(yǎng)皿底部，細胞排列緊密，部分區(qū)域可見細胞層疊現(xiàn)象。將培養(yǎng)皿放置20 ℃環(huán)境中60 min，可見貼壁細胞從培養(yǎng)皿邊緣處開始脫離，逐漸收縮，最終整個從培養(yǎng)皿底部脫離形成完整的細胞片層（圖3）。

圖1 原代培養(yǎng)的BMSCs呈長梭形或旋渦狀排列 HE×100Fig 1 The primary cultured BMSCs were arranged in fusiform or swirling HE×100

圖2 成骨誘導后的BMSCs細胞逐漸變圓，排列緊密HE×100Fig 2 BMSCs were changed to oblong and tightly arranged after differentiated into osteoblasts HE×100

圖3 細胞片層與培養(yǎng)皿底部分離，懸浮于培養(yǎng)液中Fig 3 The cell sheet completely separated from the petri dish and floated in the culture solution

2.3 BMSCs細胞片層復合PLGA支架掃描電鏡觀察

電鏡下觀察PLGA支架呈多孔網(wǎng)狀三維立體結構，孔徑為100～300 μm。BMSCs植入及細胞片層包裹支架后3 d，可見細胞伸出多個偽足黏附在支架材料表面及孔隙中（圖4）。細胞片層及分泌的細胞外基質(zhì)覆蓋于支架表面（圖5）。

2.4 大體觀察結果

16只犬全部成活并進入結果分析。術后4周，支架材料被軟組織包繞，可見明顯支架結構，支架與周圍骨斷端分界明顯，觸之較軟。實驗側與對照側差別不明顯。術后8周，雙側仍可見部分支架輪廓，骨斷端與支架結合緊密，分界不清，支架下方有少量吸收，實驗側支架吸收量少于對照側。術后12周，實驗側骨缺損大部分被新生骨組織修復，新生骨與正常下頜骨組織之間呈骨性愈合，骨斷端處未見外骨痂；對照側下頜骨下緣處骨缺損大于實驗側。術后16周，實驗側骨缺損大部分被新生骨替代，舌側形成與正常骨相似的密質(zhì)骨，與正常骨斷端骨性愈合，硬度與周圍骨組織相似（圖6上）；對照側成骨量小于實驗側，下頜骨下緣處仍可見骨缺損（圖6下）。

圖4 細胞在PLGA支架上附著生長良好 SEM×1 000Fig 4 Good cell adhesion and growth in the PLGA scaffold SEM×1 000

圖5 支架表面的BMSCs細胞片層結構 SEM×1 000Fig 5 Cell sheet microstructure on the surface of scaffold SEM×1 000

2.5 影像學觀察結果

術后標本X線片光密度值見表1。由表1可見，實驗側與對照側標本X線片光密度值隨術后時間延長逐漸增加，不同時間點之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。術后同一時間點實驗側光密度值大于對照側，兩者差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。術后16周，實驗組光密度值最高，但仍低于周圍正常骨組織（0.677±0.095）。植入材料8～16周可見不規(guī)則的骨小梁影，隨時間增長，骨小梁增多、密集。骨斷端處可見高密度骨折線（圖7）。

圖6 術后16周，實驗側（上）和對照側（下）的大體觀察結果Fig 6 The general observation of experimental side（up）and control side（down）at 16 weeks post-operation

表1 術后標本X線片光密度值Tab 1 The optical density of X-ray imaging after operationn＝4，±s

表1 術后標本X線片光密度值Tab 1 The optical density of X-ray imaging after operationn＝4，±s

分組0.31 4周8周12周16周實驗側 9±0.001 0.362±0.020 0.378±0.009 0.616±0.044對照側 0.231±0.005 0.256±0.020 0.326±0.019 0.572±0.042

圖7 術后16周，實驗側（上）和對照側（下）的X線片觀察結果Fig 7 The X-ray imaging of experimental side（up）and control side（down）at 16 weeks post-operation

2.6 組織學觀察

植入后4、8、12、16周，兩側的組織學觀察結果見圖8。術后4周，實驗側可見少量新生骨組織，骨小梁纖細，可見纖維性骨痂、多核巨細胞；骨斷端處纖維母細胞及新生血管較多。對照側新生骨較實驗側少，骨小梁纖細，不規(guī)則，可見肉芽組織。

圖8 植入后4、8、12、16周，實驗側和對照側的組織學觀察結果 HEFig 8 Histology observation of experimental side and control side at 4,8,12,16 weeks post-operation HE

術后8周，實驗側新生骨組織增多，骨小梁增粗，成骨活躍；髓腔周圍見多個骨母細胞；骨斷端處骨小梁排列紊亂，可見類骨質(zhì)。對照側成骨較實驗側少，骨小梁較細。術后12周，實驗側骨小梁較粗，增多，排列不規(guī)則，可見紅骨髓，髓腔內(nèi)血管豐富，周圍骨母細胞多。對照側骨小梁增多，較細，骨母細胞較實驗側少，血管較豐富。術后16周，實驗側骨小梁粗大，哈弗氏小管較豐富，周圍有同心圓排列的板層樣骨，骨細胞多且狀態(tài)良好，可見紅骨髓。骨髓腔中血管豐富，有較多鈣鹽沉積。對照側骨小梁較粗，可見哈弗氏系統(tǒng)，但較實驗側少。

3 討論

BMSCs可以被誘導分化成多種細胞，如成骨細胞、脂肪細胞等。由于具有這一特性，間充質(zhì)干細胞已經(jīng)被應用在很多領域與實驗中。BMSCs只有經(jīng)過特定的誘導分化，接受細胞因子的調(diào)控，合成適當?shù)募毎饣|(zhì)，才能修復病損或缺失的組織和器官，并使其具有一定的生物功能和組織結構。用BMSCs構建組織工程骨有必不可少的三要素：向成骨方向誘導分化的間充質(zhì)干細胞、具有引導成骨作用的支架材料、具有誘導和調(diào)節(jié)骨形成作用的細胞因子[5]。

本實驗將犬BMSCs經(jīng)成骨方向誘導后植入多孔的可降解的支架材料中，并在支架表面包被BMSCs細胞片層。細胞片層技術是收獲種子細胞的一種方法，可以對組織工程細胞零傷害，非蛋白酶消化，溫度誘導性收獲。溫度反應性培養(yǎng)皿底部為聚異丙基丙烯酰胺水凝膠用電輻射方法結合到聚苯乙烯培養(yǎng)皿中制作而成的。聚異丙基丙烯酰胺水凝膠為溫度反應性材料，用此培養(yǎng)皿培養(yǎng)細胞7～10 d，待細胞鋪滿培養(yǎng)皿底部后，將溫度從37 ℃降到20 ℃，細胞與培養(yǎng)皿底部化合物之間形成一層水化膜，細胞與細胞之間連接得到保留，細胞完整地與培養(yǎng)皿分離形成細胞片層[6]。避免了使用胰酶分離貼壁細胞對細胞的傷害。貼壁的細胞連同細胞下層ECM一同釋放出來。被完整保留的細胞下層ECM確保收獲的連續(xù)細胞具有完整的細胞極性，細胞-細胞連接、細胞層-細胞層間立體連接以及細胞層與移植點之間的連接。獲取細胞片層并非利用溫度反應性培養(yǎng)皿一種方法，Nakamura等[7]曾使用細胞刮刀利用普通細胞培養(yǎng)皿成功獲取了細胞片層，但這種細胞片層分離方式為利用細胞刮刀機械性的刮取，需要的技術性很高，較容易造成細胞損傷。由于細胞片層的諸多優(yōu)勢，現(xiàn)在已經(jīng)被應用于多種研究中，Sekine等[8]成功用細胞片層技術構建出具有一定功能的管狀心肌結構。Nishida等[9]利用自體口腔黏膜上皮細胞片層重建角膜組織。Zhou等[10]應用細胞片層技術構建出類似于正常骨結構的新生骨組織。本實驗BMSCs片層中細胞排列致密，類似自然骨質(zhì)形成過程中成骨細胞的排列形態(tài)。將成骨細胞組成的細胞片層包裹到多孔支架表面，隨著成骨細胞不斷的合成分泌骨基質(zhì)，以及鈣鹽的沉積和礦化，形成了由多層同心性板層骨圍繞中心哈弗氏小管和哈弗氏系統(tǒng)。

多孔支架材料需要提供給BMSCs一個暫時性的黏附并分泌基質(zhì)的環(huán)境，所以它應具有一定的支持結構，能供細胞順利長入的空隙。它還應具備一定的生物相容性和生物可降解性，一定的機械強度和可塑性[11]。本實驗所采用的PLGA支架材料具有良好的生物相容性，可應用于臨床植入。PLGA呈多孔的三維立體網(wǎng)狀結構，空隙大小最有利于細胞和血管的生長，孔隙率為85%，利于成骨細胞的生長。相對分子質(zhì)量為100 000，能夠保證支架的降解速率和新生骨的生成速率基本一致。本實驗將支架修整成上寬下窄的形狀，并在背側修出一個凹槽來容納下頜神經(jīng)血管束，使下牙槽動脈穿過支架內(nèi)部，既保證了支架復合體的穩(wěn)定，又為大塊組織工程骨血供系統(tǒng)的構建創(chuàng)造了條件。

rhBMP-2是一種具有較強誘導成骨作用的生長因子，它可以單獨誘導間充質(zhì)干細胞向成骨細胞方向分化，是骨形成過程中最關鍵的調(diào)節(jié)因子。VEGF是最有效的促血管生長因子，它能夠刺激血管內(nèi)皮細胞的增殖和生長，促進血管的發(fā)生和血管的通透性。rhBMP-2不僅具有骨誘導活性，還能上調(diào)細胞中VEGF的表達。本實驗在4～16周的標本中血管都比較豐富。應用rhBMP-2和VEGF能夠有利于形成具有豐富血管支持的大塊組織工程骨。

本實驗應用犬BMSCs細胞片層包裹含有rhBMP-2、VEGF生長因子的PLGA支架，成功構建組織工程骨，修復下頜骨缺損。新生的組織工程骨既有骨小梁和紅骨髓組成的松質(zhì)骨成分，也有哈弗氏系統(tǒng)板層骨等密質(zhì)骨成分，血管豐富，具有良好的硬度，為大塊頜骨缺損的修復提供了新思路。但組織工程骨的構建仍存在諸多問題，如細胞片層技術在獲取種子細胞時較困難，細胞片層覆蓋支架表面不能深入內(nèi)部發(fā)揮作用等尚待深入研究與解決。

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