李博，王茂芊，2，3，王華忠，2，3

（1.黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點實驗室/黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，哈爾濱150080；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所，哈爾濱150080；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北方糖料作物資源與利用重點開放實驗室，哈爾濱150080）

SRAP對東北區(qū)骨干甜菜單胚品系的遺傳多樣性分析

李博1，王茂芊1，2，3，王華忠1，2，3

（1.黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點實驗室/黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，哈爾濱150080；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所，哈爾濱150080；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北方糖料作物資源與利用重點開放實驗室，哈爾濱150080）

為了探明東北區(qū)甜菜單胚不育系的遺傳基礎(chǔ)和類群劃分，使用SRAP分子標記技術(shù)對48份東北區(qū)甜菜單胚品系骨干材料的遺傳多樣性進行分析。篩選出21對多態(tài)性較高的引物組合對供試材料進行PCR擴增，共擴增出366條帶，其中196條是多態(tài)性帶，平均多態(tài)性條帶比率是53.6%。平均遺傳距離是0.3945，平均遺傳相似系數(shù)是0.6740。利用MEGA3.1軟件，在遺傳距離0.20處，供試材料被分為5個類群。結(jié)果表明，東北區(qū)48份甜菜單胚品系骨干材料的遺傳多樣性較為豐富，利用各類不育系做親本，將可獲得雜交優(yōu)勢好的雜交組合。

甜菜；SRAP分子標記；單胚品系；遺傳多樣性

甜菜是我國主要糖料作物之一。甜菜種植歷史悠久，大約在1500年前從阿拉伯國家傳入中國。甜菜在我國的主產(chǎn)區(qū)在北緯40°以北，包括東北、華北、西北三個產(chǎn)區(qū)，其中東北種植最多，約占全國甜菜總面積的65%。伴隨著甜菜的生產(chǎn)和制糖業(yè)的發(fā)展，對甜菜品種的要求也越來越高，育種家們都在為如何培育高產(chǎn)、高糖、抗病的新品種而奮斗。已有研究表明，分子標記技術(shù)可以準確地辨別、鑒定植物品種以及確定品種間的遺傳關(guān)系[1-3]，SRAP分子標記具有簡便、準確、成本低、多態(tài)性高以及重復(fù)性好等優(yōu)點[4]，已廣泛應(yīng)用于植物種質(zhì)資源鑒定以及親緣關(guān)系分析的研究中[5-6]。因此，采用SRAP標記技術(shù)對東北區(qū)單胚品系骨干材料的親緣關(guān)系和遺傳多樣性進行分析，可為甜菜育種、推廣和利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料共48份（見表1），均為單胚二倍體品系。由黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院多倍體課題組提供。

表1 48份材料產(chǎn)質(zhì)量調(diào)查結(jié)果

1.2方法

1.2.1 DNA的提取與檢測取供試材料的單株嫩葉2片，經(jīng)冷凍真空抽干機處理，磨粉后，采用CTAB法提取DNA，樣品稀釋到10 ng/μL，置-20℃冰箱中保存。DNA濃度采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 SRAP引物的篩選用4個DNA樣品對60對SRAP引物組合（見表2）進行篩選，從中選出擴增條帶數(shù)多且較為清晰的21對引物組合用于后續(xù)PCR擴增。

1.2.3 PCR擴增及產(chǎn)物的檢測SRAP擴增程序見（表3）。SRAP-PCR體系為20μL。擴增產(chǎn)物置于4℃冰箱中保存，利用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，通過銀染法顯影，最后拍照存檔。

1.2.4 遺傳多樣性分析電泳圖譜同一位置上有清晰條帶的記為“1”，無條帶記為“0”，得到“0”和“1”組成的原始矩陣。根據(jù)Nei和Li等的方法，遺傳相似系數(shù)GS=2X12/（X1+X2），遺傳距離GD=-ln GS。X1和X2分別是成對比較的2個品種的擴增帶數(shù)，X12是共有帶數(shù)。通過Mega3.1軟件分析，使用非加權(quán)類平均法構(gòu)建聚類圖。重復(fù)運算1000次后得到自展（Boot-strap），用百分數(shù)值表示。使用軟件中的Compute over-allmean計算組內(nèi)品種間平均遺傳距離。

表2 SRAP引物序列與名稱

表3 SRAP擴增程序

表4 供試材料平均根產(chǎn)量比較

表5 SRAP引物組合、擴增帶數(shù)及多態(tài)性

2 結(jié)果與分析

2.1 生物學(xué)和經(jīng)濟性狀調(diào)查

在甜菜生長期和收獲期，分別對各個品系的植株性狀，根體形狀及根產(chǎn)量，含糖率進行調(diào)查和測定，發(fā)現(xiàn)葉片形態(tài)，根形存在一定差異，甜菜單胚品系基本上屬于中產(chǎn)低糖類型（見表1）。其中品系蘭89、蘭90為對照，平均根產(chǎn)量最低。品系蘭85、蘭86平均根產(chǎn)量最高，比對照高出77.6%；品系蘭23、蘭24平均根產(chǎn)量為31723.5 kg/hm2，高出對照31.8%（見表4）。

2.2 SRAP標記的多態(tài)性分析

利用篩選出的21對引物組合對48份甜菜材料進行PCR擴增，一共產(chǎn)生了366條擴增帶，每對引物組合產(chǎn)生15～22條條帶，平均為17.4條。其中196條擴增帶呈現(xiàn)多態(tài)性，每對引物組合產(chǎn)生7～12條，平均產(chǎn)生9.3條，每對引物組合的多態(tài)性比率是43.8%～64.7%，平均是53.6%（見表5）。結(jié)果表明，篩選出的21對引物在48份供試材料上都產(chǎn)生了特異性條帶，說明材料間遺傳差異明顯，多態(tài)性豐富。

2.3 遺傳距離與遺傳相似性分析

通過Mega3.1軟件中的Compute over-allmean計算組內(nèi)品種間平均遺傳距離，48份供試材料的平均遺傳距離是0.3945，平均遺傳相似系數(shù)是0.6740。其中材料1和2的遺傳距離最小是0.1875，而遺傳相似系數(shù)最大是0.8290，表明二者遺傳基礎(chǔ)較近。12和45遺傳距離最大0.6000，而遺傳相似系數(shù)最小0.5488，說明二者遺傳基礎(chǔ)較遠。

2.4 聚類分析

根據(jù)UPGMA方法進行聚類分析，在遺傳距離0.20處，可把供試材料分成5大類群（從上至下的順序）（圖1）。第一類群包括了23個材料，分成3個亞類：第Ⅰ亞類有10個材料，第Ⅱ亞類有8個材料，第Ⅲ亞類有5個材料。其中葉形為柳葉形，根形為楔形的材料有13個，占59.1%。第二類群包括4個材料，葉形均為舌形，根形均為紡錘形。第三類群包括4個材料，葉形都為犁鏵形，根形都為楔形。第四類群包括6個材料，葉形均為舌形，根形均為圓錐形。第五類群包括11個材料，其中葉形為舌形，根形為紡錘形的材料有10個，占90.9%。材料中有些親緣關(guān)系較近的材料，卻沒有劃分為一類，可能是由于試驗誤差或標記覆蓋不夠完全所致。

圖1 48份材料遺傳多樣性聚類圖

3 討論

SRAP是一種新型的分子標記法。在中國，SRAP分子標記已成功應(yīng)用于馬鈴薯[7]、西瓜[8]、棉花[9]等植物。近年來，中國利用分子標記方法研究甜菜的報道已有很多，但其中很少是使用SRAP分子標記進行研究的。王華忠等[10]利用SSR與SRAP分子標記相結(jié)合的方法分析了49個不同類型的甜菜材料的遺傳多樣性。王茂芊等[11]利用SRAP分子標記分析了西北地區(qū)甜菜品系的遺傳基礎(chǔ)。理論上，雜交親本應(yīng)從親緣關(guān)系較遠的材料中選擇，從而獲得優(yōu)異的創(chuàng)新品種。因此本試驗分析東北區(qū)單胚品系骨干材料的親緣關(guān)系和遺傳多樣性，可為東北區(qū)甜菜配制雜交組合提供理論指導(dǎo)，避免配制雜交組合的盲目性。聚類圖可將親緣關(guān)系較近的材料劃分為一類，說明了SRAP標記方法對于甜菜的類群劃分有較好的效果，但試驗中仍有個別特殊情況發(fā)生，如材料11與材料39親緣關(guān)系較近，卻沒有劃分為一類，可能是由于試驗誤差或標記覆蓋不夠完全所致。

4 結(jié)論

生物學(xué)和經(jīng)濟性狀調(diào)查結(jié)果顯示，供試甜菜單胚品系的葉片形態(tài)，根形都存在一定差異，均屬于中產(chǎn)低糖型，其中對照品系蘭89、蘭90平均根產(chǎn)量最低，其他參試材料均高于對照。SRAP標記的多態(tài)性分析結(jié)果表明，21對引物組合共產(chǎn)生了366條擴增帶，其中196條呈現(xiàn)多態(tài)性，平均多態(tài)性比率是53.6%。平均遺傳距離是0.3945，平均遺傳相似系數(shù)是0.6740。通過UPGMA方法進行聚類分析，在遺傳距離0.20處，可把供試材料分為5大類群。試驗結(jié)果表明，48份東北區(qū)甜菜單胚品系骨干材料遺傳多樣性較豐富，利用各類不育系做親本，將可獲得雜交優(yōu)勢好的雜交組合。

[1]高翔，龐紅喜，裴阿衛(wèi).分子標記技術(shù)在植物遺傳多樣性研究中的應(yīng)用[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2002，36（4）：356-359.

[2]李造哲，扈廷茂.分子標記及其在植物育種中的應(yīng)用[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2000，21（3）：102-105.

[3]劉春林.分子標記輔助選擇與植物品種選育[J].作物研究，1996，10（1）：47-49.

[4]雷劍，柳俊.一個與馬鈴薯青枯病抗性連鎖的SRAP標記篩選[J].中國馬鈴薯，2006，20（3）：150-153.

[5]Zhao L P，Liu LW，Gong Y Q，Wang M X，Yu FM，Wang L Z.Cultivar fingerprinting in radish（Raphanus sativus）with SRAP and AFLPmarker[J].Bulletin of Botanical Research，2007，27（6）：687-693.

[6]李莉，彭建營，百瑞霞.中國棗屬植物親緣關(guān)系的SRAP分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42（5）：1713-1719.

[7]何鳳發(fā)，楊志平，張正圣，等.馬鈴薯遺傳資源多樣性的SRAP分析[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2007，15（6）：1001-1005.

[8]李嚴，張春慶.西瓜雜交種遺傳多態(tài)性的SRAP標記分析[J].園藝學(xué)報，2005，32（4）：643-647.

[9]林忠旭，張獻龍，聶以春.新型標記SRAP在棉花F2分離群體及遺傳多樣性評價中的適用性分析[J].遺傳學(xué)報，2004，31（6）：622-626.

[10]王華忠，吳則東，王曉武，等.利用SRAP與SSR標記分析不同類型甜菜的遺傳多樣性[J].作物學(xué)報，2008，34（1）：37-46.

[11]王茂芊，張立明，王維成，王華忠.西北地區(qū)甜菜品系遺傳多樣性的SRAP分析[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2011，27（22）：156-161.

Genetic Diversity Analysis of Sugarbeet M onogerm Genotypes in the Northeast Region by SRAPM olecule M arker

LIBo1，WANGMao-qian1，2，3，WANG Hua-zhong1，2，3
（1.The Key Laboratory of SugarbeetGenetic Breeding/Institute for Crop Research，Heilongjiang University，Harbin 150080,China；2. Sugarbeet Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150080，China；3.The Key Laboratory of North Sugar Crop Resource and Utilization，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150080,China）

SRAPmolecule marker was used to test the genetic diversity of 48 monogerm genotypes of sugarbeet in order to research the genetic basis and divide class group ofmonogerm sterile lines in the northeast of China. 21 of 60 pairs primer were obtained on basis of availability.A total 366 unambiguous bands were obtained，196 of total were polymorphic.The average ratio of polymorphic bands was 53.6%，Compute over-allmean showed that genetic distance was 0.3945，genetic similarity coefficient among varieties was 0.6740.The materials were divided into five cluster groups based on cluster analysis by MEGA3.1.The genotypes of 48 materials showed high level of genetic diversity，with the sterile lines as parents，and good hybrid combinations could be obtained.

sugarbeet；SRAPmoleculemarker；monogerm lines；genetic diversity

S566.303

A

1007-2624（2012）02-0011-04

2012-01-09

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項目-國家甜菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項目：東北區(qū)甜菜育種崗位專家CARS-210104（2011-2015）。

李博（1985-），女，黑龍江省北安市人，黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院在讀碩士。

王華忠（1957-），男，研究員，主要從事甜菜育種研究。Email：wwhhzz0451@sohu.com