何海旺 ，許春燕 ，李 文 ，李創(chuàng)珍 ，韋善清 ，何龍飛

（1.廣西大學農(nóng)學院，南寧 530005；2.廣西農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所，南寧 530007）

常規(guī)的甘蔗加繁，繁殖系數(shù)低，1年僅增加種量15～20倍，極大地限制了甘蔗新品種的迅速推廣和應用[1]。利用甘蔗組培技術(shù)，實現(xiàn)工廠化育苗，已成為快速繁殖推廣應用甘蔗良種的有效途徑[2]。同時，甘蔗組培技術(shù)作為一種有效的脫毒技術(shù)[3-7]，它可以把蔗株上的花葉病、宿根矮化病等用常規(guī)方法難以防治的病害減弱，生產(chǎn)健康種苗用于生產(chǎn)，增產(chǎn)增糖效果明顯。甘蔗品種“粵糖55號”是由廣州甘蔗糖業(yè)研究所湛江甘蔗研究中心于2007年以粵農(nóng)73-204為母本、CP72-1210為父本進行雜交選育而成的甘蔗新品種[8]。該品種屬早中熟品種，萌芽快而整齊，萌芽率高，分蘗力強，前中期生長快，中后期生長穩(wěn)健，植株高，中至中大莖，莖數(shù)多，粗生耐旱，抗風力較強，宿根發(fā)株早而多，宿根性強，可保留4～5年宿根。經(jīng)試驗，粵糖55號甘蔗11—12月平均含蔗糖分為15.23%，比ROCl0甘蔗品種高1.02%（絕對值，下同），比ROCl6甘蔗品種高0.57%[8]?；浱?5號適宜廣東、廣西、云南、海南等地力中等的旱坡地、山坡地或山地推廣種植。2009年引種到廣西大學農(nóng)學院教學科研基地種植，生長表現(xiàn)良好，有良好的推廣應用前景。本研究對甘蔗品種“粵糖55號”的離體快速繁殖技術(shù)進行了研究，旨在為生產(chǎn)該品種的健康種苗，加快該品種在廣西推廣應用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

以“粵糖55號”作為試驗的品種，取生長至1m左右的甘蔗莖桿，將其切成長2cm、寬1cm、厚0.5cm帶腋芽的小塊作為外植體。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

實驗用到的培養(yǎng)基的成分見表1，所有培養(yǎng)基的pH值均為5.8。所有材料接種后均置于實驗室中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度為28±2℃，光照強度為2000lx，每天光照12h。

2 實驗結(jié)果

2.1 外植體的消毒及啟動培養(yǎng)

將切好的外植體在自來水下沖洗10min，再用70%酒精浸泡30s，倒去酒精，加入0.1%HgCl2表面消毒7min后，用無菌水沖洗4次，將表面的HgCl2沖洗干凈。消毒的外植體在啟動培養(yǎng)基（表1）上培養(yǎng)7d后，調(diào)查其污染率。在本實驗中，接種的外植體個數(shù)為96，其中有34個外植體被污染，污染率為35.4%。

外植體在啟動培養(yǎng)基上培養(yǎng)20d后，外植體上的腋芽開始萌發(fā)，本實驗共接種的外植體個數(shù)為62個，有3個褐化死亡，其余的全部萌芽，萌芽率為95.2%。萌發(fā)的腋芽生長至1cm左右時，將其從外植體上切下，接到啟動培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)30d，將從芽的周圍長出叢生芽。

2.2 繼代培養(yǎng)

把叢生芽切成單芽接種到繼代培養(yǎng)基（表1）上進行培養(yǎng)，培養(yǎng)30d后進行觀察，記錄繼代苗的各項指標。在我們前期的實驗中，當6-BA濃度為2.5mg/L時，與不同濃度的NAA（0.0mg/L、2.5mg/L、5.0mg/L）搭配，分別得到的繁殖系數(shù)為：5.89、5.55、5.45，3個不同的NAA濃度處理間未達到顯著水平。因此，本實驗設計了6-BA的濃度梯度，從中篩選出合適的6-BA濃度。從表2的結(jié)果可以看出，隨著6-BA濃度的增高，繼代苗的繁殖系數(shù)先升高，后降低，呈現(xiàn)一個明顯的拋物線規(guī)律，當6-BA濃度為1.0mg/L時，繁殖系數(shù)達最高。繼代苗的高度隨著6-BA的濃度升高而明顯降低，培養(yǎng)基中不含6-BA時最高，已超過培養(yǎng)容器的高度，但繼代苗太高，容易引起營養(yǎng)的消耗及污染，太低則苗的質(zhì)量太差，因此，應適當控制苗的高度。根據(jù)實際操作經(jīng)驗，繼代苗的高度為3～5cm最為合適。隨著6-BA濃度的增加，葉片數(shù)迅速增加，當其濃度為4.0mg/L時，在周圍長了大量松散的葉片而沒有有效芽（高度≥1cm的芽）的分化。由以上分析可知，甘蔗品種“粵糖55號”組培苗繼代的培養(yǎng)基中6-BA濃度為1.0mg/L最合適。

2.3 誘導生根

把3～5cm高的繼代苗叢生芽切成單芽，接種到生根培養(yǎng)基（表1）上進行培養(yǎng)，培養(yǎng)30d后調(diào)查甘蔗組培苗的生根數(shù)和根長。根據(jù)前期的實驗發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中6-BA的存在，將會明顯抑制根的分化，6-BA濃度為0.7mg/L時，NAA濃度從1mg/L提升到4.3mg/L均不能誘導生根。在沒有6-BA的條件下，NAA促進甘蔗組培苗生根，在0.0～4.0mg/L的NAA濃度范圍內(nèi)，生根數(shù)和根長都呈先升高后降低的趨勢。NAA濃度為2.0mg/L或3.0mg/L時，生根數(shù)和根長與其他濃度差異極顯著，2.0mg/L時最高，平均根數(shù)和平均根長分別為34.50條、3.84cm（表3）。因此，在甘蔗品種“粵糖55號”組培苗生根過程中，使用含2.0mg/L NAA的MS培養(yǎng)基最合適。

2.4 煉苗移栽

甘蔗組培苗經(jīng)生根誘導30d后，苗高大約為9cm，將其移到室外，在自然散射光下進行煉苗7d，將組培苗從瓶內(nèi)取出，用自來水沖掉培養(yǎng)基，移到用木糠作基質(zhì)的營養(yǎng)杯中進行假植，淋足定根水，假植的成活率為90%～95%。假植30d左右，待甘蔗組培苗長出新根新芽后，連基質(zhì)一起移栽到大田，成活率達100%。

3 討論

甘蔗是一種含多元酚類較高的作物，尤其是幼嫩莖尖和嫩葉鞘含量更高。在進行組織培養(yǎng)時，制備外植體和繼代過程中細胞受到破壞，細胞內(nèi)的多元酚類化合物與多酚氧化酶接觸，將酚氧化成棕色的對細胞有害的醌類物質(zhì)，醌類富集越多，顏色越深，褐化越嚴重，細胞正常生理受到破壞就越嚴重，嚴重時還通過擴散污染培養(yǎng)基，這就是所謂的酚為害或酚污染[9]。在本實驗過程中發(fā)現(xiàn)，酚污染在整個組培過程中均存在。啟動培養(yǎng)時，外植體的體積太小，則容易受酚污染為害而褐化死亡，增加外植體塊的體積能明顯地減輕酚污染對腋芽的為害，但外植體太大，則會增加外源菌的污染機率。本實驗采用長2cm、寬1cm、厚0.5cm帶腋芽的小塊作外植體比較合適。繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的酚為害也會對甘蔗組培苗的組織分化與生長產(chǎn)生一定的影響，但在本實驗過程中，未對酚污染進行處理的條件下，仍能獲得較高的繁殖系數(shù)及健壯的組培苗。因此，利用莖尖脫毒快繁甘蔗健康種苗時，酚為害主要在外植體誘導叢生芽時，而合適的外植體有利于降低酚為害，而在繼代和生根時影響不大。

據(jù)已報道的文獻[6，10-13]，大多有關(guān)甘蔗組培快繁中的繼代培養(yǎng)基（增殖培養(yǎng)基）均采用6-BA與NAA搭配使用，并且認為，當6-BA與NAA同時存在時，組培苗增殖苗數(shù)較多，但根據(jù)我們前期的實驗統(tǒng)計數(shù)據(jù)來看，這兩種激素搭配使用時，NAA濃度對甘蔗品種“粵糖55號”組培苗的繼代培養(yǎng)影響未達顯著水平，因此，建議在只含有6-BA的培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)。賢武等[7]報道，桂糖26號脫毒苗的芽增殖率隨著6-BA（1.5～2.5 mg/L）濃度的增加而提高。許莉萍等[14]報道，6-BA為5.0 mg/L處理在培養(yǎng)50 d后仍未見叢生芽，而2.0 mg/L的處理最早產(chǎn)生叢生芽。我們的實驗結(jié)果與上述報道基本一致，即在6-BA濃度在一定范圍內(nèi)促進芽的分化，但高濃度反而降低芽的分化，最適合甘蔗品種“粵糖55號”誘導叢生芽增殖的6-BA濃度為1.0mg/L。此外，由于在繼代培養(yǎng)過程中，有積累6-BA的現(xiàn)象，因此，隨著繼代培養(yǎng)的代數(shù)增加，應適當降低6-BA的濃度，以防6-BA濃度過高抑制叢生芽的分化。

許莉萍等[14]報道，同時附加6－BA和NAA的處理促根效果不如只含有NAA的處理。我們的實驗結(jié)果與之相似，即6-BA對甘蔗品種“粵糖55號”的生根誘導具有明顯的抑制作用。同時，在已報道的文獻中，對甘蔗組培苗誘導生根的NAA濃度各不相同，大多數(shù)采用高濃度的NAA（≥4.0mg/L）[10-11，14，16-17]，但也有采用相對較低濃度的NAA（≤2mg/L）[13，15]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)NAA濃度太高太低對生根誘導均不利，2.0mg/L時，誘導的根數(shù)和根長達最大值。

綜上所述，甘蔗品種“粵糖55號”腋芽的離體快速繁殖技術(shù)流程為：用帶腋芽的甘蔗莖段作外植體材料，經(jīng)0.1%HgCl2消毒7min后，接種到MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.2 mg/L的培養(yǎng)基上進行啟動培養(yǎng)，然后分別用MS+6-BA1.0 mg/L和MS+NAA2.0mg/L兩種培養(yǎng)基對甘蔗組培苗進行繼代和生根培養(yǎng)，甘蔗組培苗生根煉苗后，移到木糠中假植30d，最后把假植的甘蔗組培苗移栽大田。

[1]李海明，潘世明，李瑞美，吳松海.甘蔗組織培養(yǎng)中褐變的研究進展[J].甘蔗糖業(yè)，2003（4）：18-20.

[2]侯朝祥，趙培方，劉家勇，趙俊，吳才文，崔杰，陳學寬.影響甘蔗莖尖組培苗假植成活質(zhì)量的幾個因素分析[J].中國糖料，2010（1）：40-41，43.

[3]李松，余坤興，劉麗敏，淡明，劉紅堅，楊柳，譚芳，游建華，戴友銘.甘蔗莖尖胚狀體脫毒苗快繁技術(shù)研究[J].中國糖料，2010（4）：1-5，8.

[4]周明強，易代勇，班秀文，龔德勇，劉凡值.甘蔗脫毒種苗培育技術(shù)研究[J].貴州農(nóng)業(yè)科學，2006，34（1）：47-49.

[5]肖關(guān)麗，楊清輝，李富生，楊生超.甘蔗脫毒種苗組織培養(yǎng)技術(shù)研究[J].中國種業(yè)，2003（2）：27-28.

[6]賢武，王倫旺，唐仕云，劉海斌.桂糖21號等甘蔗新品種的莖尖脫毒培養(yǎng)技術(shù)[J].亞熱帶農(nóng)業(yè)研究，2007，3（2）：142-144.

[7]劉麗敏，李松，戴友銘，余坤興，劉紅堅，淡明.甘蔗莖尖脫毒培養(yǎng)技術(shù)研究[J].中國糖料，2009（2）：18-20.

[8]楊俊賢，安玉興，黃振瑞，劉福業(yè)，吳文龍，潘方胤，黃振豪.甘蔗新品種粵糖55號的選育[J].廣東農(nóng)業(yè)科學，2008（8）：19-21.

[9]秦廷豪，鄒宗蘭，吳才文.淺析甘蔗組培中的酚害[J].甘蔗，1997，4（2）：12-14.

[10]李松，余坤興，劉麗敏，淡明，劉紅堅，楊柳，譚芳，游建華，戴友銘.甘蔗莖尖胚狀體脫毒苗快繁技術(shù)研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2011，39（2）：83-87.

[11]何洪良，唐君海，藍慶江，秦昌鮮，趙靜，唐利球，陸祖正.甘蔗新品系桂糖02-901的離體快繁技術(shù)[J].農(nóng)業(yè)研究與應用，2011，133（2）：62-63.

[12]吳才文，秦廷豪，鄒宗蘭.甘蔗組培苗快速增殖技術(shù)研究[J].甘蔗糖業(yè)，1997（5）：8-13.

[13]黃誠梅，李楊瑞，葉燕萍.甘蔗組織培養(yǎng)與快速繁殖[J].作物雜志，2005（4）：25-26.

[14]許莉萍，傅華英，潘大仁.甘蔗腋芽快速繁殖培養(yǎng)基及激素配方的篩選[J].福建農(nóng)業(yè)大學學報，2000，29（4）：401-404.

[15]張金蓮，楊鳳剛，王軍.甘蔗組培快繁技術(shù)研究[J].云南農(nóng)業(yè)科技，2005（4）：15.

[16]劉紅堅，李松，游建華，莫磊興，余坤興，劉麗敏，戴友銘，淡明.甘蔗莖尖脫毒組培苗生根試驗的研究初報[J].甘蔗糖業(yè)，2008（2）：18-20.

[17]劉麗敏，李松，余坤興，劉紅堅，淡明，戴友銘.甘蔗新品系桂糖02-901和02-467組培苗生根試驗[J].中國糖料，2010（1）：27-29.