孫 旭 肖志剛 馬秀婷 李 良

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

玉米蛋白粉（corn gluten meal，CGM）是濕法生產(chǎn)玉米淀粉時主要副產(chǎn)物，其蛋白質(zhì)含量達60%以上，主要成分為醇溶蛋白（68%）、谷蛋白（22%）、球蛋白（1.2%）和白蛋白［1］。由玉米蛋白酶解生成的玉米肽具有水溶性好、溶解度不受pH 影 響、高濃度低黏度［2］等特點，并具有抗氧化［3，4］、降血壓［5］、抗疲勞［6，7］、促進乙醇代謝［8，9］等生理活性。但在酶解過程中，為了維持反應(yīng)體系pH 的恒定，需要不斷加入堿溶液，導(dǎo)致體系中存在大量的無機鹽。這些無機鹽不僅影響玉米肽的口感，對理化性質(zhì)的測定及生理活性的研究都有一定的負(fù)作用；此外，在蛋白水解液中還含有未完全水解的蛋白質(zhì)、酶及有機膠體等雜質(zhì)［10］，這些會限制其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用。因此，需要對玉米蛋白水解液進行脫鹽，精制玉米肽。

目前，生物活性物質(zhì)較常用的脫鹽方法有離子交換樹脂法和大孔吸附樹脂法。大孔吸附樹脂的分離機理是吸附原理和分子篩原理，主要是通過分子間疏水相互作用對分子進行吸附，因此大孔吸附樹脂不僅可以脫鹽還可以保留水解物中的疏水性肽段。大孔吸附樹脂是由苯乙烯、二乙烯苯、二甲丙烯酸酯等聚合而成的網(wǎng)狀孔穴結(jié)構(gòu)，為非離子的高分子吸附劑，具有成本低、選擇性好、吸附容量大、回收率高、容易再生等特點［11，12］。

本試驗選用大孔吸附樹脂DA201－C 為吸附劑，對玉米蛋白水解液進行脫鹽試驗，確定最佳解吸劑，并進一步研究pH 值、樣品濃度及上樣速度對玉米多肽回收率的影響，為玉米多肽的后續(xù)分離、純化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米蛋白粉：長春大成玉米開發(fā)有限公司；

2709堿性蛋白酶：88 244 U／g，棗莊市杰諾生物酶有限公司；

大孔吸附樹脂層析柱：Φ2.6cm×30cm，上海華美實驗儀器廠；

DA201－C 大孔吸附樹脂：江蘇蘇青水處理工程集團有限公司；

其它試劑：分析純，市售。

1.2 儀器與設(shè)備

食品蒸煮擠壓機：DS56－Ⅲ型，濟南賽信膨化機械有限公司；

振蕩培養(yǎng)箱：BS－2E型，金壇市國旺實驗儀器廠；

超微量分光光度計：K5600 型，北京凱奧科技發(fā)展有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 玉米多肽的制備 將一定條件下擠壓膨化出的玉米蛋白粉烘干、粉碎、過篩，按料液比1∶10（m∶V）加水調(diào)制，置于三角瓶中，在酶與底物比10%，pH 為9.5，溫度為55 ℃條件下酶解4h，95 ℃滅酶15min，反復(fù)離心（10 000r／min，20min）3次，合并上清液，上清液即為玉米多肽溶液。

1.3.2 大孔吸附樹脂的預(yù)處理 用無水乙醇浸泡樹脂24h，使其充分溶脹，然后用無水乙醇洗至流出液加水不呈白色渾濁為止，而后用去離子水充分洗凈乙醇。然后用5%HCl溶液浸泡樹脂3h，而后用去離子水洗至水洗液呈中性，最后用2% NaOH 溶液浸泡樹脂3h，再用去離子水洗至水洗液呈中性備用。

1.3.3 大孔吸附樹脂對玉米多肽的靜態(tài)吸附及解吸 將15mL樹脂加入到250 mL 的具塞錐形瓶中，向其中加入濃度為30mg／mL的玉米蛋白水解液15mL，將錐形瓶置于搖床中（轉(zhuǎn)速為160r／min），室溫振蕩12h，至吸附平衡，每隔30min取樣進行分析。選擇水和不同濃度的乙醇（35%，55%，75%，95%）作為洗脫劑，對已達到吸附飽和的樹脂進行24h解吸。

1.3.4 大孔吸附樹脂對玉米多肽的動態(tài)吸附及解吸 采用2.6cm×30cm 規(guī)格的層析柱，將DA201－C大孔吸附樹脂裝入層析柱中。在室溫條件下，將玉米多肽溶液以一定的濃度、pH、速度流進層析柱，用紫外檢測器檢測流出液的A220nm。先用去離子水洗滌層析柱，洗脫液每8 mL 收集1管，取每管中1mL稀釋50倍，測定其電導(dǎo)率，直至洗脫液的電導(dǎo)率與去離子水相當(dāng)，用75%濃度的乙醇進行洗脫，收集洗脫峰，冷凍干燥。

1.3.5 工藝條件的確定

（1）酶解液pH 對多肽回收率的影響：在室溫條件下，將肽 濃度 為30 mg／mL 的 酶 解 液pH 值 分 別 調(diào) 為7，8，9 以2BV／h的流速上樣，用去離子水洗滌層析柱，直至洗脫液的電導(dǎo)率與去離子水相當(dāng)，用75%濃度的乙醇進行洗脫，以多肽的回收率為指標(biāo)，確定最佳酶解液pH。

（2）酶解液濃度對多肽回收率的影響：在室溫條件下，將肽溶液（pH＝8）分別配置成15，30，45mg／mL 以2BV／h的流速上樣，用去離子水洗滌層析柱，直至洗脫液的電導(dǎo)率與去離子水相當(dāng)，用75%濃度的乙醇進行洗脫，以多肽的回收率為指標(biāo)，確定最佳酶解液濃度。

（3）酶解液流速對多肽回收率的影響：在室溫條件下，將肽濃度為30mg／mL的酶解液（pH＝8）分別以1.0，1.5，2.0BV／h的流速上樣，用去離子水洗滌層析柱，直至洗脫液的電導(dǎo)率與去離子水相當(dāng)，用75%濃度的乙醇進行洗脫，以多肽的回收率為指標(biāo)，確定最佳酶解液流速。

1.3.6 測定項目及方法

（1）肽含量的測定：Folin－酚法。

（2）灰分含量的測定：馬弗爐灰化法（GB／T 5009.4——2010）。

（3）相關(guān)指標(biāo)的測定：按式（1）～（5）計算。

2 結(jié)果與討論

2.1 大孔吸附樹脂對玉米多肽的靜態(tài)吸附及解吸

2.1.1 大孔吸附樹脂對玉米多肽的靜態(tài)吸附能力 DA201－C大孔吸附樹脂對玉米多肽的靜態(tài)吸附率和吸附量隨時間的變化規(guī)律見圖1。

圖1 大孔吸附樹脂對玉米多肽的吸附曲線Figure 1 Static adsorption curves of MAR DA201－C to corn peptides

由圖1可知，大孔吸附樹脂對玉米多肽的靜態(tài)吸附過程中，在最初的2h內(nèi)，吸附率和吸附量隨時間的增加而不斷增加，尤其在前0.5h增加非常迅速，而2h后吸附率和吸附量隨時間的增加無明顯變化，說明2h左右時已到達樹脂吸附的飽和，吸附平衡時的吸附率為92.32%，吸附量為27.7mg／mL，說明對玉米多肽DA201－C 大孔吸附樹脂表現(xiàn)出良好的吸附性能。

2.1.2 大孔吸附樹脂對玉米多肽的靜態(tài)解吸 由表1 可知，在所選的解吸劑中，水的解析率最低，乙醇溶液的解析率隨乙醇含量的增加而增大，75%乙醇的解析率最高。無水乙醇的解析率比75%乙醇的解析率低，這可能是因為玉米多肽在無水乙醇中溶解程度有限［13］，致使解析率下降，所以選用75%乙醇為解吸劑。

表1 不同濃度的乙醇溶液對玉米多肽的靜態(tài)解吸效果Table 1 Effect of ethanol concentration on static desorption of the resin

2.2 大孔吸附樹脂對玉米多肽的動態(tài)吸附及解吸

大孔吸附樹脂對玉米多肽動態(tài)吸附過程的電導(dǎo)率和A220nm隨洗脫體積的變化曲線見圖2。由圖2可知，用去離子水洗滌層析柱時，洗脫液的電導(dǎo)率先升高后降低，出現(xiàn)一個洗脫峰后，電導(dǎo)率變化逐漸平緩，說明層析柱中的無機鹽離子基本被洗出。隨后，用75%乙醇洗脫層析柱，洗脫曲線的拖尾現(xiàn)象可能是由于玉米多肽溶液中大分子組分在75%乙醇溶液中溶解性不佳，無法完全洗脫所致。

圖2 大孔吸附樹脂對玉米多肽吸附和脫鹽效果Figure 2 Dynamic adsorption and desalination of MAR DA201－C to corn peptides

2.3 工藝條件的確定

通過研究玉米蛋白酶解液pH 值、多肽濃度、上樣速度對流經(jīng)大孔吸附樹脂DA201－C 溶液的多肽回收率的影響，確定最佳工藝條件，結(jié)果見圖3～5。

由圖3可知，當(dāng)pH 為8 時，玉米多肽回收率最高，當(dāng)pH 為7或9時，玉米多肽回收率略有下降，可能是在此pH條件下，大孔吸附樹脂對玉米多肽的吸附能力降低。因此確定最佳pH 為8。

圖3 pH 對玉米多肽回收率的影響Figure 3 Effects of pH value on recovery of corn peptides

圖4 樣品濃度對玉米多肽回收率的影響Figure 4 Effects of concentration of corn peptides on recovery

圖5 樣品流速對玉米多肽回收率的影響Figure 5 Effects of flow rate on recovery of corn peptides

由圖4可知，隨著樣品濃度的增加，玉米多肽回收率呈下降趨勢。這是因為樣品濃度較低時，玉米肽能夠與樹脂充分接觸，在疏水相互作用條件下，能更有效地被樹脂吸附。但隨樣品濃度的降低，試驗周期就會延長，雖然30 mg／mL比15mg／mL的樣品肽回收率低，但可以縮短一半周期，當(dāng)樣品濃度為45mg／mL 時，肽損失較多。綜合考慮后，定最佳樣品濃度為30mg／mL。

由圖5可知，樣品流速對肽回收率也有一定影響。當(dāng)樣品流速為1BV／h時，肽回收率較高，隨著樣品流速的增加，肽回收率下降，但相差不大。綜合考慮后，確定最佳樣品流速為2BV／h。

根據(jù)上述結(jié)果，確定玉米多肽脫鹽工藝的條件為樣品pH 為8，濃度為30mg／mL，樣品流速為2BV／h。

2.4 脫鹽效果分析

在最佳工藝條件下對玉米多肽溶液進行脫鹽，對脫鹽前后玉米多肽的分析結(jié)果見表2。

由表2可知，大孔吸附樹脂脫鹽后玉米多肽中蛋白質(zhì)含量明顯增加，灰分含量大大降低，脫鹽率達90%以上，脫鹽效果良好。因此，采用DA201－C 大孔吸附樹脂可以有效的去除玉米蛋白酶解液中的無機鹽。

表2 脫鹽前后玉米多肽的成分對比Table 2 Composition of corn peptides before and after desalting

3 結(jié)論

采用大孔吸附樹脂DA201－C對玉米蛋白水解液進行脫鹽處理是一種簡便有效的方法。較佳的工藝條件為樣品pH 8，多 肽 濃 度30 mg／mL，上 樣 速 度2 BV／h，洗 脫 劑 為75%乙醇。在此條件下，玉米多肽回收率為79.67%，脫鹽率達90.10%。目前對大孔吸附樹脂應(yīng)用和性能研究已經(jīng)相當(dāng)廣泛，雖然存在一些不足，如缺乏藥用標(biāo)準(zhǔn)，在應(yīng)用中缺乏規(guī)范化的技術(shù)要求等，但與其它常規(guī)脫鹽方法相比，大孔吸附樹脂法優(yōu)點在于費用低、操作簡單、條件溫和，可以避免加熱、化學(xué)處理等過程造成有效成分活性的降低。另外，作為洗脫劑的乙醇解吸性能較佳，具有沸點低，利于回收利用的特點。本試驗為玉米多肽的進一步富集純化研究奠定基礎(chǔ)，在后續(xù)試驗中可對玉米多肽的分子量以及生理活性展開研究。

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