唐 正 劉 镕 趙琴平 明珍平 鐘沁萍 蔣明森 董惠芬

武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體寄生蟲學(xué)教研室，武漢430071；＃通訊作者

目的：鈣連蛋白（Canx）在蛋白質(zhì)合成中起重要作用，存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中需Ca2+的凝集素樣分子伴侶蛋白，可與新合成的尚未折疊完全的蛋白質(zhì)的寡糖鏈結(jié)合，防止蛋白質(zhì)彼此聚集和泛素化，避免折疊不完全的蛋白質(zhì)離開內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；同時(shí)也可促進(jìn)其它伴侶蛋白與這些蛋白質(zhì)結(jié)合，使其折疊完全。無論是曼氏血吸蟲還是日本血吸蟲，僅有與Canx相似的鈣結(jié)合蛋白的研究報(bào)道。本文報(bào)道與宿主相關(guān)的日本血吸蟲Canx基因的克隆、表達(dá)，為研究其功能奠定基礎(chǔ)。方法：提取日本血吸蟲成蟲總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。設(shè)計(jì)引物用常規(guī)PCR法擴(kuò)增出Canx編碼基因，在設(shè)計(jì)引物時(shí)，切除了含21個(gè)氨基酸的信號肽，并加上了BamH I和Xho I酶切位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物切膠回收后使用BamH I和Xho I雙酶切，然后使用同樣的酶雙酶切pET-28a質(zhì)粒?；蚝唾|(zhì)粒連接后轉(zhuǎn)化DH5α宿主菌，使用卡那霉素篩選陽性克隆后測序。將測序結(jié)果與已發(fā)表的序列進(jìn)行比對，選取序列準(zhǔn)確的克隆擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化BL21宿主菌，并以1mM IPTG作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)，收集、純化重組蛋白。結(jié)果：PCR產(chǎn)物跑膠后獲得長度為1 880bp左右的Canx基因特異性產(chǎn)物。經(jīng)酶切、連接、轉(zhuǎn)化后對DH5α宿主菌做菌液PCR，出現(xiàn)特異性條帶。測序后將菌株轉(zhuǎn)入BL21誘導(dǎo)表達(dá)，SDSPAGE檢測，發(fā)現(xiàn)在95KD左右有特異性條帶，比預(yù)測的質(zhì)量大，但經(jīng)過尿素變性后，大小與預(yù)測相當(dāng)，約72KD。大量表達(dá)后收集、純化重組蛋白質(zhì)。結(jié)論：構(gòu)建了含日本血吸蟲Canx基因的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-Canx，并誘導(dǎo)表達(dá)、純化了Canx基因的重組蛋白，為深入研究基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

＊國家自然科學(xué)基金（81273010）