熊 濤 劉 镕 趙琴平 明珍平 鐘沁萍 蔣明森 董惠芬

武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體寄生蟲學(xué)教研室，武漢430071；＃通訊作者

目的：課題組前期研究已經(jīng)篩選出日本血吸蟲肺期童蟲的差異基因-生長激素誘導(dǎo)的跨膜蛋白（GHITM）基因，其可能在日本血吸蟲的生長發(fā)育中起關(guān)鍵作用。本文克隆、表達(dá)GHITM基因，以便進(jìn)一步探索其在血吸蟲生長發(fā)育過程中的作用。方法：根據(jù)GHITM基因的序列，分別設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)的GHITM基因引物，以日本血吸蟲成蟲的總RNA為模板進(jìn)行RT-PCR，PCR產(chǎn)物提純后使用EcoR I和Xho I雙酶切，然后與使用同樣酶雙酶切的pET-28a-c質(zhì)粒連接并轉(zhuǎn)化DH5α宿主菌，使用卡那霉素篩選陽性克隆后測序。將測序結(jié)果與已發(fā)表的序列進(jìn)行比對，選取序列準(zhǔn)確的克隆擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化BL21宿主菌，并用1mM IPTG誘導(dǎo)其表達(dá)，SDS-PAGE鑒定，鎳柱親和層析純化重組蛋白。結(jié)果：通過使用設(shè)計(jì)的特異性引物，RT-PCR后獲得長度為1 000bp左右的GHITM基因特異性產(chǎn)物；PCR產(chǎn)物切膠回收，表達(dá)載體與目的片段同時(shí)雙酶切，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化后隨機(jī)挑取10個(gè)陽性克隆，行PCR篩選，瓊脂糖凝膠電泳檢測后測定其序列，挑選突變率最低的克隆擴(kuò)大培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化宿主菌并誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)在分子量為42KD左右有一特異性條帶，純化獲得了GHITM蛋白。結(jié)論：成功構(gòu)建了含GHITM基因的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-c，并誘導(dǎo)表達(dá)了GHITM蛋白。

＊國家自然科學(xué)基金（81273010）