周世娟 鐘惠香 陳錦順 呂福應(yīng) 郭國(guó)才 黎敦鎮(zhèn)

廣東省惠東縣中醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東惠東 516300

流行病學(xué)研究表明，當(dāng)今世界范圍內(nèi)，由質(zhì)粒所介導(dǎo)的產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended spectrum beta lactamases，ESBLs）是細(xì)菌耐藥的主要機(jī)制之一[1-2]。產(chǎn)ESBLs陰性桿菌多見(jiàn)于大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌等。近幾十年來(lái)，隨著廣譜抗菌藥物的廣泛使用，產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌已成為目前院內(nèi)感染最常見(jiàn)的耐藥菌之一[3-4]。廣泛耐藥的大腸埃希菌給疾病治療帶來(lái)了嚴(yán)重的挑戰(zhàn)，嚴(yán)重影響著醫(yī)療質(zhì)量，同時(shí)還增加了患者的經(jīng)濟(jì)支出，因此，明確產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的耐藥機(jī)制、研制新的治療靶點(diǎn)以及減少細(xì)菌耐藥率成為現(xiàn)階段的研究熱點(diǎn)之一[5]。本研究擬收集筆者所在醫(yī)院產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌，分析其主要耐藥率和基因突變情況，并通過(guò)分子生物學(xué)方法明確基因堿基突變的主要類型，為今后進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌標(biāo)本的來(lái)源

標(biāo)本收集時(shí)間為2012年1 ～ 5月，標(biāo)本來(lái)源主要為惠東縣中醫(yī)院臨床科室，包括：血、尿、痰、大便、穿刺液、分泌物、膽汁中分離的純培養(yǎng)菌株。采用法國(guó)Biomerieux公司的API鑒定試劑條（API 20E）進(jìn)行鑒定，并用產(chǎn)ESBLs表型確證實(shí)驗(yàn)篩選出產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌86株：按CLSI文件M100-S20（2010年版）判斷標(biāo)準(zhǔn)：頭孢他啶和頭孢噻肟中任何一種藥物，加克拉維酸與相應(yīng)不加克拉維酸后抑菌環(huán)直徑相比，增大5 mm及以上時(shí)判斷為ESBLs陽(yáng)性。

1.2 抗菌藥物的使用

本研究所采用的藥物如下：頭孢拉定（CRD，杭州賽諾菲萬(wàn)安特民生制藥有限公司， H33022275）、氨芐西林（AMP，廣州白云山制藥股份有限公司，H20043038）、頭孢呋辛（CXM，葛蘭素史克公司，H20030365）、頭孢他啶（CAZ，葛蘭素史克公司，J20030063）、頭孢哌酮/舒巴坦（SPR，輝瑞制藥有限公司，H20020597）、氨曲南（ATM，中美上海施貴寶制藥有限公司，H10970024）、亞胺培南/西司他?。═N，默沙東制藥有限公司，J20080046）、美羅培南[MP，住友制藥（蘇州）有限公司，J20100045]、左氧氟沙星[LFX，第一三共制藥（北京）有限公司，H20000655]、阿米卡星（AMK，蘇州一藥有限公司，H20090327）。

1.3 熒光定量PCR反應(yīng)

所有標(biāo)本均送中山大學(xué)達(dá)安基因公司進(jìn)行檢測(cè)，采用熒光定量PCR法檢測(cè)大腸埃希菌TEM型β-內(nèi)酰胺酶基因，PCR試劑盒由中山大學(xué)達(dá)安基因公司提供。

Forward Primer（正向引物）：5’-GGCTGGTTAACGACGTTACGACT-3’，Reverse Primer（反向引物）： 5’-AAACGTTCAGGACGGGCTA-3’。肺炎克雷伯菌ATCC700603為陽(yáng)性對(duì)照，大腸埃希菌ATCC25922為陰性對(duì)照。

儀器：ABI 7500全自動(dòng)熒光定量PCR儀，ABI 9700 PCR儀，ABI 3900臺(tái)式高通量DNA合成儀，科大創(chuàng)新HC-3018R高速冷凍離心機(jī)。

1.4 藥敏試驗(yàn)分析

本研究采用瓊脂稀釋法測(cè)定藥物最低抑菌濃度（minimal inhibition concentration，MIC），方法和藥敏判斷標(biāo)準(zhǔn)按照CLSI文件M100-S20（2010年版）規(guī)定。β-內(nèi)酰胺酶類抗菌藥物測(cè)定采用MIC法；非β-內(nèi)酰胺酶類抗菌藥物則采用臨界濃度法測(cè)定藥物敏感性。培養(yǎng)基為Mueller-Hintom瓊脂（OXOID，Basingstoke，UK）。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

1.5 DNA序列測(cè)定及分析

用ABI 377全自動(dòng)測(cè)序儀對(duì)TEM酶全編碼基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行序列分析，測(cè)序結(jié)果在PUBMED Genebank在線比較基因序列。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌基因型

本課題所收集并分離的86株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌，其中TEM基因型49株（57.0%），SHV基因型16株（18.6%），CTX-M基因型21株（24.4%）；TEM分型主要有TEM-1、TEM-2、TEM-105、TEM-116和TEM-128，其中TEM-1和TEM-2型例數(shù)最多，分別為19例和17例。

2.2 產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌耐藥性分析

由表1可見(jiàn)，醫(yī)院產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌TEM型耐藥發(fā)生率較高；除亞胺培南/西司他丁和美羅培南敏感外，所有基因亞型細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺酶類和非β-內(nèi)酰胺酶類抗菌藥物均耐藥。

2.3 產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌TEM基因堿基突變類型

由表2可見(jiàn)，產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌TEM基因堿基突變類型包括缺失、堿基置換、移碼和插入，其中缺失發(fā)生率最高，其次為堿基置換，而移碼突變和插入突變較少。

表1 產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌TEM分型及耐藥性

表2 產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌TEM基因突變類型

3 討論

本研究結(jié)果表明，目前惠東地區(qū)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌基因類型主要為TEM、SHV和CTX-M 三種類型，其中TEM基因型最常見(jiàn)，約占57.0%，而SHV和CTX-M基因型分別為18.6%和24.4%。TEM基因型中TEM-1和TEM-2所占例數(shù)最多，分別為18例和17例?；蚍治鼋Y(jié)果表明，產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌TEM基因突變類型主要為缺失和堿基置換。藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，除亞胺培南/西司他丁和美羅培南敏感外，所有TEM基因亞型細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺酶類和非β-內(nèi)酰胺酶類抗菌藥物均耐藥。

近年來(lái)，大量臨床研究結(jié)果表明，產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌耐藥率呈逐年上升的趨勢(shì)，且逐漸成為院內(nèi)感染的頭號(hào)致病菌[6]。不同基因亞型ESBLs對(duì)藥物的敏感性和耐藥率存在較大的差異，導(dǎo)致臨床工作中時(shí)常出現(xiàn)同種細(xì)菌對(duì)同種抗菌藥物表現(xiàn)出不同耐藥性的現(xiàn)象[7]，嚴(yán)重影響著抗菌藥物的選擇，因此，探討某一地區(qū)主要致病菌耐藥發(fā)生率、抗菌藥物敏感性、耐藥基因類型以及主要堿基突變類型對(duì)指導(dǎo)抗菌藥物的選擇、改善醫(yī)療質(zhì)量具有重要的臨床價(jià)值和社會(huì)意義。

ESBLs主要包括TEM、SHV、CTX-M和OXA四種類型[7-8]。其中SHV和OXA為TEM的主要衍生物。既往研究報(bào)道TEM型ESBLs大腸埃希菌發(fā)病率逐漸增高，且各地區(qū)流行的基因亞型各不相同。近年來(lái)國(guó)內(nèi)有關(guān)TEM 型ESBLs報(bào)道不斷增多，TEM主要包括TEM-1型和TEM-2型，并發(fā)現(xiàn)了許多新的亞型，但目前尚未見(jiàn)惠東地區(qū)該酶的分子流行病學(xué)研究報(bào)道。TEM-1型ESBLs酶是革蘭陰性菌最常見(jiàn)的β-內(nèi)酰胺酶[9]。既往文獻(xiàn)報(bào)道90%以上大腸埃希菌對(duì)氨芐西林耐藥是由TEM-1 型ESBLs所介導(dǎo)[10]。TEM-1 型ESBLs能夠水解青霉素以及頭孢類抗菌藥物，從而導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥。TEM-2型是由TEM-1型單個(gè)氨基酸的替換衍生而來(lái)。研究表明，不同的基因類型可導(dǎo)致同一種抗菌藥物對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的敏感性不同[11]。因此，積極尋找不同基因型ESBLs大腸埃希菌的生物學(xué)特點(diǎn)對(duì)于指導(dǎo)抗菌藥物的選擇及應(yīng)用具有重要的臨床意義。本研究結(jié)果在一定程度上反應(yīng)惠東地區(qū)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的流行病學(xué)情況，耐藥基因主要類型和堿基突變位點(diǎn)，以及對(duì)抗菌藥物的敏感性，從而在一定能夠程度上彌補(bǔ)了本地區(qū)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌流行病學(xué)情況的空白，也在一定程度上為臨床醫(yī)師抗菌藥物的選擇提供理論。

綜上所述，筆者認(rèn)為，在今后研究中，可進(jìn)一步增加樣本收集量，從而使該項(xiàng)研究結(jié)果具有更好的代表性。

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