朱龍寶，湯 斌，陶玉貴，葛 飛，魏勝華，陳 濤，李婉珍

（安徽工程大學(xué) 生化學(xué)院，安徽 蕪湖 241000）

纖維素是重要的可再生生物質(zhì)資源，在解決能源和環(huán)境問(wèn)題中起到重要作用。纖維素酶高效水解纖維仍然是生物法生產(chǎn)燃料乙醇的一個(gè)技術(shù)瓶頸[1]。纖維素被降解為葡萄糖至少需要3種纖維素酶，分別是β-1，4-葡聚糖甘內(nèi)切酶、纖維二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶，在前兩種酶的作用下生成纖維二糖，纖維二糖最終在β-葡萄糖苷酶的作用下水解成葡萄糖[2]。纖維二糖和纖維寡糖是纖維素酶系的抑制劑，為了解除其抑制作用，其中的β-葡萄糖苷酶活性成為纖維素高效降解的關(guān)鍵因素。雖然β-葡萄糖苷酶也受到自身產(chǎn)物葡萄糖的抑制，但可以通過(guò)控制糖化和發(fā)酵過(guò)程解決[3]。β-葡萄糖苷酶對(duì)纖維素糖化水解具有關(guān)鍵性作用，但微生物所產(chǎn)纖維素酶系中β-葡萄糖苷酶所占比例不足1%，這使得β-葡萄糖苷酶成為纖維素降解成單糖的關(guān)鍵因素[4]，工業(yè)上通過(guò)往纖維素酶水解系統(tǒng)中添加β-葡萄糖苷酶來(lái)提高纖維的水解效率[5]。

微生物中β-葡萄糖苷酶酶活高的菌種主要是霉菌，A.niger是優(yōu)良的產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌，國(guó)內(nèi)目前對(duì)β-葡萄糖苷酶的研究還主要在β-葡萄糖苷酶的生產(chǎn)菌種選育和在大腸桿菌中表達(dá)，產(chǎn)酶水平低，難以提取純化[6-7]。酵母表達(dá)系統(tǒng)兼有大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)：便于培養(yǎng)，基因操作，成本低，繁殖快，又可對(duì)真核基因產(chǎn)物進(jìn)行翻譯后加工，得到有活性的蛋白質(zhì)。其中選用表達(dá)載體pPIC9K含有分泌型信號(hào)肽，利于胞外表達(dá)。通過(guò)抗生素濃度梯度篩選得到高拷貝數(shù)的基因整合到染色體DNA上，在提高表達(dá)量的基礎(chǔ)上也保證后代的遺傳穩(wěn)定性。唐德芳[8]在篩選出一株黑曲霉的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步構(gòu)建酵母工程菌，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)，β-葡萄糖苷酶比活力達(dá)7.85 U/mg，但未報(bào)導(dǎo)其發(fā)酵產(chǎn)酶水平。陳士華[9]采用pPICZaA載體構(gòu)建的重組菌在誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h后，發(fā)酵液的酶活力可達(dá)到0.78 U/mL，還不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)要求。為進(jìn)一步提高產(chǎn)酶水平，作者擬構(gòu)建酵母工程，實(shí)現(xiàn)高效分泌表達(dá)β-葡萄糖苷酶，為解決β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量低、成本高等問(wèn)題提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種和質(zhì)粒

黑曲霉（Aspergillus niger）：購(gòu)自工業(yè)微生物菌種保藏中心；畢赤酵母Pichia pastoris GS115、大腸桿 菌 E.coli JM109、BL21、pMD-18T 和 pPIC9K 載體：均購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司。

1.2 培養(yǎng)基與主要試劑

pfu DNA聚合酶、T4DNA連接酶、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、RNA 提取試劑盒、pNPG、DNA marker、G418、瓊脂糖、氨芐青霉素、IPTG、X-gal：均購(gòu)自上海生工；各種限制性內(nèi)切酶：購(gòu)自 NEB公司；LB、YPD、BMGY、BMMY培養(yǎng)基：參照Invitrogen公司產(chǎn)品使用手冊(cè)。

1.3 方法

1.3.1 基因克隆 將黑曲霉樣品液氮速凍后立即研磨，用Trizol試劑提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，步驟如下：將 50 μL 體系的反應(yīng)液（3 μg RNA，1 μL oligodT）65 ℃變性 5 min， 冰上冷卻 5 min。 再加入 5 μL 10×buffer， 1 μL M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶，0.5 μL逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，37℃反應(yīng)1 h，70℃變性10 min。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中Aspergillus niger的bgl基因序列（GI:159034137），采用 Premier5 軟件設(shè)計(jì) 引 物 ：Primer1:5-CGGTAC GATGAGGTTCA CTTTGATCGA-3;primer2：5′-CGGCGGCCGCTTAG TGAACAGTAGGCA GAG-3′。

PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性1 min，58℃退火 30 s，72 ℃延伸 3 min，25個(gè)循環(huán)，PCR產(chǎn)物割膠回收，克隆到pMD-18T載體，構(gòu)建pMD-18T-bgl，轉(zhuǎn)化 E.coli Jm109，在含有氨芐抗性的LB平板挑轉(zhuǎn)化子，送上海生工測(cè)序。

1.3.2 重組表達(dá)載體pPIC9K-bgl的構(gòu)建 用SnaBⅠ和 NotⅠ分別雙酶切pMD-18T-bgl和空載體pPIC9K，膠回收純化后于16℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化E.coli JM109，在含有氨芐（50 μg/mL）抗性的 LB 平板挑轉(zhuǎn)化子，提取重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，陽(yáng)性克隆即pPIC9K-bgl。

1.3.3 畢赤酵母電擊轉(zhuǎn)化、篩選 用BglII線性化重組質(zhì)粒pPIC9K-bgl，電轉(zhuǎn)化100 μL感受態(tài)畢赤酵母細(xì)胞，對(duì)照為BglII線性化pPIC9K空載體，使用MD培養(yǎng)基和MM培養(yǎng)基對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行初篩，30℃培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落。為獲得多拷貝bgl基因的菌株，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種于YPD/G418平板上，30℃培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落，G418質(zhì)量濃度梯度依次為0.5、1、2、4 mg/mL，最后采用PCR擴(kuò)增進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.4 重組畢赤酵母的培養(yǎng) 將鑒定的陽(yáng)性克隆單菌落接種至10 mL YPD培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24 h，1 mL培養(yǎng)液接入50 mL BMGY，30℃培養(yǎng)24 h，離心收集菌體，用25 mL BMMY培養(yǎng)基重懸培養(yǎng)，1%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。分別于 24、48、72、96、120 h 取樣，離心收集上清液，用 25 mmol/L Tris-HCl（pH 7.0）緩沖液在透析袋中過(guò)夜透析后測(cè)定酶活性。

1.3.5 重組β-葡萄糖苷酶的SDS-PAGE 將重組畢赤酵母誘導(dǎo)培養(yǎng)于50 mL的YPD培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min培養(yǎng)72 h。發(fā)酵液于4℃離心，8 000 r/min 離心 4 min，取上清液 40 μL 于 10 μL 5×上樣緩沖液混合均勻，水中煮沸2 min，取 20 μL進(jìn)行SDS-PAGE。

1.3.6 溫度和pH值對(duì)重組β-葡萄糖苷酶的影響將重組β-葡萄糖苷酶酶液在不同pH緩沖液中（pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）50 ℃保溫 30 min；在不同溫度下 （30、40、50、60、70、80 ℃） 保溫 30 min后加入100 μL三氯乙酸終止反應(yīng)，檢測(cè)酶活力。

1.3.7 β-葡萄糖苷酶酶活測(cè)定 pNPG為底物測(cè)定β-葡萄糖苷酶活性，最適反應(yīng)條件下每分鐘催化底物水解產(chǎn)生1 μmol對(duì)硝基苯酚的酶量為1 U[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取及RT-PCR結(jié)果

將提取的總RNA上瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) （圖1A）， 可以看到 rRNA 清晰的 3 條帶：28S，18S，5S，RNA樣品的OD260/OD280比值在2.0左右，RNA質(zhì)量較好，能滿足RT-PCR實(shí)驗(yàn)要求。使用目的基因特異性引物，進(jìn)行RT-PCR，得到2.5 kb左右的一條DNA 條帶（圖 1B）。

2.2 pMD-18T-bgl重組子篩選與檢測(cè)

重組質(zhì)粒pMD-18T-bgl轉(zhuǎn)化到感受態(tài)E.coli JM109后用藍(lán)白斑的方法進(jìn)行篩選，隨機(jī)挑取3個(gè)白斑培養(yǎng)，提取質(zhì)粒電泳檢測(cè)，見圖2。根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小，其中有2個(gè)可能是陽(yáng)性克隆子。將這2種質(zhì)粒進(jìn)行PCR驗(yàn)證，得到了約2.5 kb左右的條帶，與目的基因條帶一致，初步表明RT-PCR產(chǎn)物TA克隆成功。測(cè)序結(jié)果表明：該基因的cDNA閱讀框2583 bp，將cDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)分析。通過(guò)同源性比較可知，該cDNA與GenBank中已公布的黑曲霉Aspergillus niger CBS513.88 β-葡萄糖苷酶基因的核苷酸序列同源性高達(dá)99%[11]，證明該cDNA全序列是黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因。

圖1 總RNA電泳圖片（A）和 RT-PCR產(chǎn)物電泳圖（B）Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA extracted from Aspergillus niger（A）and RT-PCR production of bgl gene（B）

圖2 重組質(zhì)粒PCR驗(yàn)證結(jié)果Fig.2 PCR production of pMD-18T-bgl plasmid

2.3 pPIC9K-bgl分泌表達(dá)載體的構(gòu)建

用SnaBⅠ和NotⅠ分別雙酶切pMD18-T-bgl和pPIC9K表達(dá)載體，連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli JM109。篩選氨芐抗性的重組克隆提取質(zhì)粒，用SnaBⅠ和NotⅠ雙酶切驗(yàn)證重組克隆中含有β-葡萄糖苷酶基因bgl，結(jié)果見圖3。重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-bgl可以用于畢赤酵母的轉(zhuǎn)化。

2.4 畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的篩選與PCR驗(yàn)證

通過(guò)G418抗菌素平板上篩選出的陽(yáng)性重組子，在MD、MM平板上，30℃培養(yǎng)觀察其生長(zhǎng)情況。選擇其中表型為His+Muts進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證和酶活測(cè)定分析。挑取3個(gè)陽(yáng)性克隆至YPD培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min，培養(yǎng)36 h，提取基因組DNA，以primer1和primer2為引物進(jìn)行PCR，電泳結(jié)果見圖4。陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子均含有β-葡萄糖苷酶基因片段。

圖3 SnaBⅠ和NotⅠ雙酶切驗(yàn)證重組質(zhì)粒pPIC9K-bglFig.3 Restriction analysis of recombinant plasmid pPIC9K-bgl

圖4 重組表達(dá)載體PCR產(chǎn)物Fig.4 PCR production of pPIC9k-bgl plasmid from P.pastoris GS115

2.5 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

酵母轉(zhuǎn)化子經(jīng)甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)后，上清液進(jìn)行SDS-PAGE。圖5聚丙烯酰胺凝膠電泳圖表明，β-葡萄糖苷酶基因在畢赤酵母GS115中得到表達(dá)，重組子誘導(dǎo)培養(yǎng)后，上清液SDS-PAGE上出現(xiàn)明顯的條帶，對(duì)照菌株畢赤酵母（pPIC9K）無(wú)此條帶。

圖5 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖Fig.5 SDS-PAGE of expressing product

2.6 不同發(fā)酵時(shí)間內(nèi)重組β-葡萄糖苷酶的酶活

挑選酶活最高的重組酵母再進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，每隔24 h測(cè)定一次酶活，其產(chǎn)酶曲線見圖6?？梢钥闯?，其β-葡萄糖苷酶酶活在連續(xù)誘導(dǎo)的前72小時(shí)一直呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，72 h以后便不再增長(zhǎng)，呈緩慢下降趨勢(shì)。

圖6 P.pastoris GS115 β-葡萄糖苷酶酶活測(cè)定曲線Fig.6 Curve of P.pastoris GS115 β-glucosidase activity

2.7 溫度和pH值對(duì)重組β-葡萄糖苷酶的影響

將重組酵母誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h后，在不同pH值反應(yīng)條件下測(cè)得酶活力。以pH值為橫坐標(biāo)，酶活力為縱坐標(biāo)，作出pH曲線，見圖7。從圖7可以看出，β-葡萄糖苷酶的最適pH為5.5。在pH 4.0～7.0的范圍內(nèi)，β-葡萄糖苷酶均有活性。在最適pH值條件下，分別在30～80℃溫度條件下測(cè)定重組β-葡萄糖苷酶的活力，該酶最適反應(yīng)溫度為50℃，在30～70℃之間均有酶活性。

圖7 溫度和pH值對(duì)重組β-葡萄糖苷酶的影響Fig.7 Effect of temperature and pH on the activity of recombinant β-glucosidase

3 結(jié)語(yǔ)

β-葡萄糖苷酶在醫(yī)藥、食品、飼料、造紙、印染、紡織、石油開采及生物技術(shù)研究等多方面得到了廣泛的應(yīng)用，構(gòu)建的工程酵母來(lái)高效表達(dá)β-葡萄糖苷酶，以解決目前β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量低、成本高等問(wèn)題。由于釀酒酵母細(xì)胞膜上缺少通透酶，使得纖維二糖不能進(jìn)入胞內(nèi)，因此需使編碼β-葡萄糖苷酶的外源基因帶有信號(hào)肽能夠被分泌到胞外，從而增加工程酵母菌株降解纖維素的能力，以便更好利用纖維素及纖維二糖來(lái)生產(chǎn)乙醇，為纖維素高效降解、生產(chǎn)燃料乙醇提供有效的解決途徑。采用RT-PCR技術(shù)成功擴(kuò)增出β-葡萄糖苷酶全長(zhǎng)基因bgl，構(gòu)建克隆載體pMD-18T-bgl。測(cè)序結(jié)果表明：bgl全長(zhǎng)2 583 bp，可編碼一個(gè)860個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，與β-葡萄糖苷酶基因（XM001398779.1）核苷酸序列同源性為99%，氨基酸序列同源性為99%，屬于β-葡萄糖苷。將重組pMD-18T-bgl中的bgl插入酵母分泌表達(dá)載體pPIC9K中，構(gòu)建了表達(dá)載體pPIC9K-bgl，成功實(shí)現(xiàn)在Pichia pastoris GS115高效表達(dá)，獲得與預(yù)期大小相一致的重組蛋白質(zhì)。陳士華采用pPICZaA載體構(gòu)建的重組菌在誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h后，發(fā)酵液的酶活力可達(dá)到0.78 U/mL。作者所構(gòu)建的工程菌發(fā)酵上清液中β-葡萄糖苷酶的最高酶活達(dá)到38 U/mL，提高近50倍。發(fā)酵上清液中蛋白質(zhì)主要是酶蛋白，雜蛋白質(zhì)較少，后續(xù)的分離純化過(guò)程就相對(duì)簡(jiǎn)單，分離步驟較少，為后續(xù)的發(fā)酵放大提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]Van Maris A J A， Annott D T， Bellissimi E， et al.Alcoholic fermentation of carbon sources in biomass hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae:current status[J].Antonie Van Leeuwenhoek， 2006， 90 （4）:391-418.

[2]Kim K H，Brown K M，Harris P V，et al.A proteomics strategy to discover beta-glucosidases from Aspergillus fumigatus with two dimensional page in gel activity assay and tandem mass spectrometry[J].Journal of Proteome Research， 2007，6（12）：4749-4757.

[3]Leontina G I，álvaro L ，Julio P ，Julia M N.Fermentation of cellobiose to ethanol by industrial Saccharomyces strains carrying the β-glucosidase gene （BGL1） from Saccharomycopsis fibuligera[J].Bioresource Technology， 2011，102:5229-5236.

[4]石彩蕊，王義強(qiáng)，陳介南.產(chǎn)β-葡萄糖苷酶微生物育種研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào)，2011，3:59-65.SHI Cai-rui,WANG Yi-qiang,CHEN Jie-nan.Research progress of breeding for β-glucosidase strain[J].Biotechnology Bulletin,2011,3:59-65.（in Chinese）

[5]Lynd L R，Weimer P J，Van Zyl W H，et al.Microbial cellulose utilization:fundamentals and biotechnology[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews， 2002， 66:506-577.

[6]朱婧，覃擁靈，陳桂光，等.葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株的選育及酶法轉(zhuǎn)化葡萄糖生產(chǎn)龍膽低聚糖[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36（4）:21-24.ZHU Jing,QIN Yong-ling,CHEN Gui-guang,et al.Selection of the high β-glucosidase mutant and production of gentiooligosaccharid[J].Food and Fermentation Industries,2010,36(4):21-24.（in Chinese）

[7]張益波，王娟，何歡，韓微，等.β-葡萄糖苷酶新型高產(chǎn)菌株篩選及其液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].微生物學(xué)通報(bào)，2011，38（6）:809-815.ZHANG Yi-Bo,WANG Juan,HE Huan,HAN Wei,et al.Production of β-glucosidase by a novel isolated strain Tolypocladium cylindrosporum syzx4 and statistical optimization of fermentation media[J].Microbiology,2011,38(6):809-815.（in Chinese）

[8]唐德芳，裴小瓊，李曉璐，等.黑曲霉β-葡萄糖苷酶的篩選、克隆及表達(dá)[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2009，15（3）:423-426.TANG De-fang,PEI Xiao-qiong,LI Xiao-lu,et al.Screening,cloning and expression of Aspergillus niger β-glucosidase[J].Journal of Applied&Environmental Biology,2009，15(3):423-426.（in Chinese）

[9]陳士華，耿瑞凡，薛珍，等.黑曲霉bgl基因在畢赤酵母中的表達(dá)研究[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，31（5）：42-45.HEN Shi-hua,GENG Rui-fan,XUE Zhen,et al.Research on the expression of bgl gene of Aspergillus niger in Pichia pastoris[J].Journal of Henan University of Technology,2010,31（5）:42-45.（in Chinese）

[10]李華，高麗.β-葡萄糖苷酶活性測(cè)定方法的研究進(jìn)展[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2007，26（2）:107-112.LI Hua,GAO Li.Research advance on methods of determining β-glucosidase activity[J].Journal of Food Science and Biotechnology[J].2007,26(2):107-112.（in Chinese）

[11]Pel H J，Winde J H，Archer D B.Genome sequencing and analysis of the versatile cell factory Aspergillus niger CBS 513.88[J].Nature Biotechnology， 2007，25（2），221-231.