李維虎 ，鄭飛云 ，劉春鳳 ，李永仙 ，李 崎 *

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122）

啤酒泡沫性能包括起泡性、泡持性、掛杯性以及潔白細(xì)膩程度等[1]，是啤酒有別于其它酒類的重要特征之一。其中蛋白質(zhì)對(duì)起泡性和維持泡沫結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定具有重要作用。啤酒泡沫蛋白質(zhì)主要來(lái)源于大麥，具有較強(qiáng)的疏水性，疏水性越強(qiáng)，泡沫越穩(wěn)定[2-5]。在啤酒釀造過(guò)程中，由于酶、高溫等因素，蛋白質(zhì)的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)經(jīng)歷了大而復(fù)雜的變化，蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性、溶解性和抗酶水解的能力都有很大程度的提高[6-9]，進(jìn)而影響啤酒及啤酒泡沫的穩(wěn)定性。

蛋白質(zhì)理化性質(zhì)改變的本質(zhì)是蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。采用圓二色譜技術(shù)對(duì)啤酒泡沫和麥芽中的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行比較與研究，并利用單向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 （SDS-PAGE）與液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC-MS/MS）對(duì)泡沫蛋白質(zhì)進(jìn)行分離與鑒定。研究初步揭示了泡沫蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及蛋白質(zhì)組成，豐富了泡沫蛋白質(zhì)的理論研究，對(duì)揭示啤酒泡沫穩(wěn)定性機(jī)制有一定推進(jìn)意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

1.1.1 主要試劑 protein marker：大連寶生物技術(shù)公司產(chǎn)品；trypsin：sigma公司產(chǎn)品； 丙烯酰胺，N，N′-甲叉雙丙烯酰胺，SDS（十二烷基硫酸鈉），Tris（三羥基甲烷氨基丙烷），甘氨酸，TEMED（N，N，N'，N'-四甲基乙二胺），DTT（二硫蘇糖醇），β-巰基乙醇，CAN（乙腈），碘乙酰胺：均為分析純。

1.1.2 主要儀器 圓二色譜儀MOS-450/AF-CD：法國(guó)Bio-Logic公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)UVP公司產(chǎn)品；LCQ Deca XPplus液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀：美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品；垂直板電泳儀：DYY-8 C，北京六一儀器公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)eppendorf公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 啤酒泡沫蛋白樣品制備 取600 mL啤酒緩緩倒入分液漏斗中充分起泡，靜止10 s，分液除去液體部分，收集泡沫濃縮液；4℃下用質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%硫酸銨沉淀，8 000 g離心15 min，棄去上清液，沉淀用60%硫酸銨溶液洗滌兩次，用適量pH 7.5磷酸緩沖液溶解，透析過(guò)夜，用BaCl2檢驗(yàn)透析效果，然后冷凍干燥。

1.2.2 熒光分光光度法測(cè)蛋白質(zhì)疏水性 蛋白質(zhì)樣品用pH 7.0的10 mol/L磷酸緩沖液分別稀釋一系列質(zhì)量濃度：0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 μg/μL，分別取 4 mL，一式兩份，其中一份加入 20 μL濃度為8 mol/L的ANS溶液，另外一份不加ANS的蛋白質(zhì)溶液作為空白。振蕩混勻，然后測(cè)其熒光強(qiáng)度（FI）。熒光條件：激發(fā)波長(zhǎng)390 nm，發(fā)射波長(zhǎng)470 nm。以熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)濃度作圖，初始段的斜率即為蛋白質(zhì)分子的表面疏水性指數(shù)H。

1.2.3 圓二色譜法（CD）分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu) 取制備好的蛋白質(zhì)樣品適量溶于超純水，稀釋到0.1 mg/mL進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定條件：0.1 cm石英比色杯，溫度 25℃，光徑 0.1 cm，帶寬 1 nm，掃面范圍 250～190 nm，速度 0.5 nm/s，用平均殘基摩爾橢圓率[θ]表示CD光譜數(shù)據(jù)，單位deg·cm2/dmol，通過(guò)在線引擎采用SELCON3方法計(jì)算蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)（http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/home.shtml）。

1.2.4 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳 根據(jù)文獻(xiàn)[10]，分離膠質(zhì)量濃度 15 g/dL（1 mm×80 mm×80 mm），濃縮膠質(zhì)量濃度4 g/dL，蛋白質(zhì)樣品溶于上樣緩沖液 （62.5 mmol/L Tris-HCl，pH 6.8， 質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%SDS，20%甘油，5%β-巰基乙醇，0.01%溴酚藍(lán)），沸水中水浴 5 min，上樣量 15 μL，濃縮膠電壓為80 V，分離膠電壓調(diào)整為200 V，待溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距離分離膠下邊緣1 cm左右時(shí)關(guān)閉電源，結(jié)束電泳，凝膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)G-250染色，脫色后拍照保存。

1.2.5 膠內(nèi)酶切 據(jù)文獻(xiàn) [11]作適當(dāng)修改，選取SDS-PAGE凝膠上所需分析的條帶，切膠后進(jìn)行膠內(nèi)酶切。從膠上切下考馬斯亮藍(lán)染色的蛋白質(zhì)條帶，轉(zhuǎn)移到小EP管中，加10 mmol DTT的50 mmol NH4HCO3溶液，56℃、45 min進(jìn)行還原處理。加55 mmol碘乙酰胺的50 mmol NH4HCO3溶液室溫避光30 min進(jìn)行烷基化處理。加100 mL 50%ACN的50 mmol NH4HCO3溶液，室溫振蕩30 min，可重復(fù)操作，直到膠粒脫去考馬斯亮藍(lán)的藍(lán)色。加入100 μL ACN，室溫放置15 min后吸去ACN，抽真空離心干燥。 加入20 μL測(cè)序級(jí)胰蛋白酶 （10 ng/μL，sigma）4 ℃放置 45 min，吸取多余酶液，加入 10 μL、50 mmol NH4HCO3，37℃孵育酶解16 h。吸取小EP管中的酶解液放入干凈EP管中；向原EP管加入30 μL 5%甲酸-50%ACN，漩渦振蕩 30 min，提取液加入含酶解液的EP管中，重復(fù)提取一次。肽段提取液用speed vac（真空離心蒸發(fā)濃縮器）徹底抽干后，-20℃保存。

1.2.6 蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析 酶切完成后用Ziptip C18將肽片段脫鹽[12]，抽干后用0.1%甲酸溶解，用于液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜分析。質(zhì)譜數(shù)據(jù)用SEQUEST軟件在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索和匹配。

2 結(jié)果與討論

2.1 泡沫蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)包括蛋白質(zhì)多肽鏈的折疊和盤繞方式，主要有α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角以及無(wú)規(guī)則卷曲等單元組分。圓二色（Circular Dichroism，簡(jiǎn)寫為CD）光譜法是分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的研究工具，遠(yuǎn)紫外區(qū)是肽鍵的吸收范圍，可以反映主鏈的構(gòu)象，不同二級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)或多肽產(chǎn)生的CD光譜譜帶位置、吸收強(qiáng)弱有差異，通過(guò)CD圖譜可以計(jì)算蛋白質(zhì)α-螺旋和β-折疊等組分的含量[13]。通常典型α-螺旋結(jié)構(gòu)在208 nm和222 nm左右有2個(gè)負(fù)峰，在192 nm有1個(gè)正峰，β折疊在214 nm處有1個(gè)負(fù)峰，β轉(zhuǎn)角在206 nm有1個(gè)正峰，無(wú)規(guī)則卷曲在200 nm附近有1個(gè)負(fù)峰，在210～230 nm有1個(gè)正峰。實(shí)驗(yàn)測(cè)定了啤酒泡沫和麥芽中蛋白質(zhì)水溶液的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖1。同時(shí)檢測(cè)了兩種蛋白質(zhì)的表面疏水性指數(shù)，結(jié)果見圖2。

圖1 大麥芽和泡沫蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)CD圖譜Fig.1 CD spctra of barley malt proteins and foam proteins

圓二色（CD）圖譜顯示，泡沫蛋白質(zhì)在190～250 nm遠(yuǎn)紅外區(qū)有1個(gè)明顯的負(fù)吸收峰，最大負(fù)吸收位置在202 nm附近，并未表現(xiàn)出α-螺旋特有的雙負(fù)峰CD特征。為了對(duì)比泡沫蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，對(duì)啤酒泡沫蛋白質(zhì)來(lái)源——麥芽蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行CD光譜掃描。結(jié)果顯示，麥芽蛋白質(zhì)在208 nm和222 nm左右處有2個(gè)負(fù)峰，在192 nm附近有1個(gè)正峰，具有典型的α-螺旋雙負(fù)峰結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。根據(jù)Levitt[14]對(duì)規(guī)則蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分類，麥芽蛋白質(zhì)屬于全α-型，其中208 nm處負(fù)峰是由于α-螺旋π-π*躍遷所致，222 nm附近負(fù)峰對(duì)應(yīng)于n-π躍遷[15]。CD圖譜顯示，啤酒中的泡沫蛋白質(zhì)已經(jīng)失去釀造前麥芽蛋白質(zhì)中α-螺旋的典型雙負(fù)峰結(jié)構(gòu)，反映了蛋白質(zhì)發(fā)生了明顯的去折疊，α-螺旋減少，無(wú)規(guī)則卷曲特征增加明顯，從而190～220 nm之間平均殘基摩爾橢圓率負(fù)值增加，208 nm峰位藍(lán)移至202 nm左右，主要是由于無(wú)規(guī)則卷曲的增加和α-螺旋特征疊加的結(jié)果，222 nm附近的負(fù)峰被β-折疊產(chǎn)生的弱正峰補(bǔ)平，形成幾乎沒(méi)有起伏的斜坡。蛋白質(zhì)這種明顯的去折疊現(xiàn)象可能與啤酒釀造過(guò)程中劇烈條件對(duì)蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的影響有密切關(guān)系。先前報(bào)道[9，16]指出，煮沸階段是影響蛋白質(zhì)去折疊的重要階段，來(lái)自麥芽浸出物的還原性物質(zhì)有利于LTP1發(fā)生去折疊，并且蛋白質(zhì)的去折疊對(duì)LTP1表面活性的表達(dá)有重要作用[17]。

圖2 大麥芽和泡沫蛋白質(zhì)的表面疏水指數(shù)Fig.2 Surface hydrophobic index of barley malt proteins and foam proteins

使用SELCON3方法對(duì)圓二色譜的掃描數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算后得到蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)各單元含量，見表1所示。與麥芽蛋白質(zhì)相比，泡沫蛋白質(zhì)的α-螺旋的相對(duì)含量低，有較多的β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲。蛋白質(zhì)表面疏水性測(cè)定結(jié)果見圖2。泡沫蛋白質(zhì)的疏水性高于麥芽蛋白質(zhì)，疏水蛋白質(zhì)對(duì)啤酒泡沫穩(wěn)定性有明顯的積極的作用，β-折疊有較多的非極性殘基，可以在蛋白質(zhì)內(nèi)部形成疏水核心[18]，增加蛋白質(zhì)的疏水性。疏水蛋白質(zhì)由于表面活性可以富集在氣泡的表面，在氣-液界面形成粘滯薄膜，降低氣泡的表面張力，從而有利于泡沫的穩(wěn)定性。據(jù)文獻(xiàn)[19]報(bào)道，賴氨酸殘基位于α-螺旋的區(qū)域，其糖基化修飾會(huì)影響該區(qū)域的結(jié)構(gòu)，因此糖基化可能也是引起泡沫蛋白α-螺旋含量較低的因素之一。泡沫蛋白的無(wú)規(guī)則卷曲含量較多，有較大的柔性，展開的多肽鏈上氨基酸殘基的暴露不僅有利于蛋白質(zhì)的疏水性，而且可能更有利于蛋白質(zhì)的修飾（如賴氨酸殘基糖基化修飾[20]），使得泡沫蛋白質(zhì)具有很好的雙親性和表面活性，從而對(duì)啤酒泡沫性能發(fā)揮作用。

表1 麥芽蛋白質(zhì)和啤酒泡沫蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量Tab.1 Contents of second structures of malt proteins and foam proteins

2.2 泡沫蛋白質(zhì)的提取和SDS-PAGE分離

對(duì)冷凍干燥后的啤酒泡沫蛋白進(jìn)行SDSPAGE電泳，結(jié)果見圖3。蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量主要分布在40 000左右和5 000～20 000之間，并未發(fā)現(xiàn)66 000蛋白質(zhì)條帶[16]。圖3是凝膠分析軟件Gel-Pro Analyzer根據(jù)光密度得到的膠內(nèi)蛋白質(zhì)條帶分布，便于較準(zhǔn)確切膠。根據(jù)蛋白質(zhì)膠內(nèi)條帶結(jié)合光密度分析掃描圖，共分為5份，分別收集每份膠條置于小EP管中進(jìn)行膠內(nèi)酶解。

2.3 啤酒泡沫蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析

用LCQ-Deca XP plus對(duì)膠內(nèi)酶解的肽段進(jìn)行質(zhì)譜分析，共得到5套質(zhì)譜數(shù)據(jù)，經(jīng)過(guò)SEQUEST軟件在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)搜索和配對(duì)，共鑒定出11種來(lái)自大麥的可信度較高蛋白質(zhì)，見表2。有5個(gè)電泳條帶由3種或3種以上蛋白質(zhì)組成，說(shuō)明泡沫蛋白質(zhì)組分的復(fù)雜。這些蛋白質(zhì)包括較完整的蛋白質(zhì)Z4和LTP1（脂轉(zhuǎn)移蛋白），還有蛋白質(zhì)Z4的不完整片段、BDAI-1（大麥α-淀粉酶抑制劑二聚體-1）以及hordein（大麥醇溶蛋白）片段；另外還鑒定出CMa、CMb、CMd（均屬于α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑家族）、CMe（屬于胰蛋白酶抑制劑家族）、BMAI-1（大麥α-淀粉酶抑制劑單聚體-1）和WMAI-1（小麥-淀粉酶抑制劑單聚體-1）。

圖3 泡沫蛋白質(zhì)的SDS-PAGE圖Fig.3 SDS-PAGE of foam proteins

圖4 泡沫蛋白凝膠光密度分析剖面圖Fig.4 Relative densitometric profile of foam protein gel

本次鑒定啤酒泡沫蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)40 000的條帶為蛋白質(zhì) Z4，未發(fā)現(xiàn) Z7，有實(shí)驗(yàn)證明[17，21]，蛋白質(zhì)Z4與泡沫穩(wěn)定性的相關(guān)性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Z7。同時(shí)，在低相對(duì)分子質(zhì)量區(qū)域檢測(cè)到蛋白質(zhì)Z4不完整片段，郝俊光在檢測(cè)泡沫蛋白質(zhì)時(shí)也檢測(cè)到Z4片段[22]，Gianluca等[23]檢測(cè)到Z4和LTP1的C-末端片段，因此盡管普遍認(rèn)為泡沫蛋白質(zhì)有較強(qiáng)的抗酶解能力，但是在一定的條件下可能會(huì)受到麥芽酶或酵母蛋白酶A的影響。LTP1來(lái)自大麥胚乳蛋白部分，具有很強(qiáng)的起泡性能。LTP包括LTP1和LTP2兩種多肽，LTP2含量?jī)H有LTP1的1/10，但實(shí)驗(yàn)未檢測(cè)到LTP2存在。BDAI–1疏水性較強(qiáng)，能被糖基化和磷基化，對(duì)泡沫穩(wěn)定性起積極作用[24]，也可能參與渾濁形成[25]。只檢測(cè)到30196.2的醇溶蛋白片段。先前報(bào)道[22，26-28]稱啤酒中部分醇溶蛋白對(duì)泡沫穩(wěn)定和啤酒渾濁有重要作用，最近研究發(fā)現(xiàn)[23，25]，啤酒中醇溶蛋白很少，未檢測(cè)到完整蛋白質(zhì)，不存在較完整結(jié)構(gòu)，因此它們對(duì)泡沫的貢獻(xiàn)非常有限。CMa、CMb、CMd和CMe相對(duì)分子質(zhì)量較低，含量很少，脯氨酸含量不高，屬于酶抑制劑系列，可能增強(qiáng)啤酒蛋白質(zhì)的抗酶水解能力。據(jù)文獻(xiàn) [29-31]報(bào)道BMAI-1和WMAI-1都是一種昆蟲α-淀粉酶抑制劑，兩者在泡沫中的作用目前未知，有待進(jìn)一步研究。

表2 蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定結(jié)果匯總Tab.2 Summary of protein identification by mass spectrometry analysis followed by a database search

經(jīng)過(guò)復(fù)雜的釀造過(guò)程，留在啤酒中的蛋白質(zhì)種類仍然很多，但大部分已經(jīng)不完整，且空間構(gòu)象已經(jīng)發(fā)生改變，變性和去折疊，導(dǎo)致多肽鏈伸展，這些蛋白質(zhì)可能由于結(jié)構(gòu)的改變從而產(chǎn)生了有利于提高啤酒泡沫性能的性質(zhì)。蛋白質(zhì)Z4維持泡沫穩(wěn)定性，LTP1具有較強(qiáng)的起泡性，完整的蛋白質(zhì)Z4和LTP1可能作為“核心”維持啤酒泡沫性能，而其他蛋白質(zhì)組分作為參與者共同決定泡沫性能。釀造過(guò)程中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的復(fù)雜性以及泡沫蛋白質(zhì)組成的多樣性在一定程度上說(shuō)明了啤酒泡沫機(jī)制的復(fù)雜性。

3 結(jié)語(yǔ)

圓二色（CD）譜結(jié)果顯示，啤酒泡沫蛋白質(zhì)在195 nm處有1個(gè)正峰，在202 nm附近有1個(gè)最大負(fù)峰，與釀造前的麥芽蛋白相比，其二級(jí)結(jié)構(gòu)并未表現(xiàn)出α-螺旋特有的雙負(fù)峰特征，β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲相對(duì)含量較高，并且泡沫蛋白質(zhì)的疏水性高于麥芽蛋白質(zhì)，因此這種結(jié)構(gòu)有利于泡沫蛋白質(zhì)的疏水性，從而有利于啤酒泡沫的穩(wěn)定性。經(jīng)質(zhì)譜鑒定，啤酒泡沫蛋白中共有11種來(lái)自麥芽的可信度較高蛋白質(zhì)， 包括蛋白 Z、LTP1、BDAI-1， 以及 CMa、CMb、CMd、CMe、BMAI-1、WMAI-1 等酶抑制劑和少量醇溶蛋白，其含量很少，可能參與啤酒泡沫穩(wěn)定性和渾濁，其作用尚待探索。蛋白質(zhì)在釀造前后結(jié)構(gòu)發(fā)生很大變化，并且泡沫蛋白組成復(fù)雜，因此關(guān)于蛋白質(zhì)在釀造過(guò)程結(jié)構(gòu)、組成和性質(zhì)的變化有待進(jìn)一步分析與研究，為探索泡沫蛋白質(zhì)的泡沫穩(wěn)定性機(jī)制奠定一定的理論基礎(chǔ)，以期對(duì)實(shí)際生產(chǎn)作出理論指導(dǎo)。

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