段春宇 張永根 辛杭書 王志博 夏 科 李富國

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030)

甲烷是反芻動(dòng)物瘤胃正常消化的產(chǎn)物，瘤胃內(nèi)排放的甲烷量占甲烷排放總量的15%～25%，由此引起的溫室效應(yīng)約占全球溫室效應(yīng)的2%［1］;瘤胃內(nèi)甲烷的排放也會(huì)造成能量的浪費(fèi)，據(jù)報(bào)道，反芻動(dòng)物甲烷排放損失的能量占到飼料攝入能量的2% ～12%［2］。因此，如何減少反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)甲烷的生成已成為反芻動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)研究的重點(diǎn)。

調(diào)控瘤胃甲烷生成的因素較多，應(yīng)用比較廣泛的是在飼糧中添加離子載體，如莫能菌素、拉沙里霉素等，它們可以改變瘤胃發(fā)酵模式，增加丙酸產(chǎn)量，降低乙酸與丙酸的比值，并能有效降低甲烷產(chǎn)量，從而有效提高飼料的能量利用率［3－4］。海南霉素是中國科學(xué)院上海藥物研究所近年研制的國內(nèi)第1個(gè)羧基型聚醚類離子載體，它與瘤胃素、鹽霉素結(jié)構(gòu)相似，與莫能菌素有許多共同之處，是一種新型的反芻動(dòng)物飼料添加劑［5］。據(jù)報(bào)道，海南霉素具有保護(hù)瘤胃肽和可溶性蛋白質(zhì)的作用［6］，并能改變山羊瘤胃發(fā)酵類型，顯著提高丙酸比例，抑制飼料蛋白質(zhì)在瘤胃內(nèi)的降解［7］;在體外發(fā)酵試驗(yàn)中，有效減緩瘤胃pH下降，減少產(chǎn)氣量，減少氨態(tài)氮(NH3-N)的濃度，降低乙酸與丙酸比值等［8］。但海南霉素在奶牛生產(chǎn)中的應(yīng)用效果還鮮有報(bào)道，基于此，本試驗(yàn)旨在通過研究奶牛飼糧中添加海南霉素對(duì)其瘤胃發(fā)酵模式及甲烷產(chǎn)量的影響，為海南霉素在反芻動(dòng)物飼養(yǎng)中的有效利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與飼糧組成

試驗(yàn)選用3頭體重約為500 kg、安裝有永久性瘤胃瘺管的健康荷斯坦奶牛?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1，基礎(chǔ)飼糧精粗比為50∶50。海南霉素:純度≥90%(山東勝利股份有限公司);莫能菌素:純度≥90%(美國禮來公司)。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(DM basis) %

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用3×3拉丁方試驗(yàn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)設(shè)負(fù)對(duì)照組(不添加任何添加劑)、正對(duì)照組(添加10 mg/kg莫能菌素)和海南霉素組(添加7.2 mg/kg海南霉素)。每期試驗(yàn)預(yù)試期10 d，正試期 5 d，共 15 d。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)香坊試驗(yàn)基地進(jìn)行。試驗(yàn)牛拴系飼養(yǎng)，每天飼喂2次(08:00和20:00)，先粗后精，自由飲水。將海南霉素和莫能菌素分別添加在精料中，混勻飼喂，每天觀察并記錄牛只采食情況。

1.4 樣品采集

試驗(yàn)期第 1、2 天晨飼后0、2、4、6、8 和10 h 采集瘤胃液，2層紗布過濾，一部分采集后用于pH及NH3-N的測(cè)定，另外準(zhǔn)確量取4 m L采集的瘤胃液和1 m L 25%偏磷酸于10 m L的離心管中，用于測(cè)定揮發(fā)性脂肪酸(VFA)的濃度，樣品均置于－20℃冷凍保存。試驗(yàn)期第4、5天用呼吸面罩收集呼出的氣體，每日于晨飼后 0、2、4、6、8和 10 h測(cè)定6次，每次10 m in，氣體總量用 SAILSORS V10FC-VM流量計(jì)(北京塞爾瑟斯儀表科技有限公司)計(jì)數(shù)［9－11］。用氣相色譜儀分析氣體中甲烷的含量。

1.5 樣品分析

1.5.1 pH 的測(cè)定

取出瘤胃液后，用Sartorius PB－10型酸度計(jì)(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)立即測(cè)定pH。

1.5.2 瘤胃液NH3-N的測(cè)定

取出瘤胃液后，用奧立龍ORION EA－940雙通道專業(yè)型離子濃度(ISE)測(cè)定儀(上海碩光電子科技有限公司)測(cè)定瘤胃液中NH3-N的濃度。

1.5.3 瘤胃VFA 的測(cè)定

用島津GC－2010氣相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。以Erw in等［12］建立的方法為依據(jù)，并對(duì)色譜柱的選擇和色譜操作條件進(jìn)行了優(yōu)化。

1.5.3.1 樣品處理

將冷凍保存的樣品放在4℃冰箱中解凍，離心(5 400 r/m in，10 m in)去除飼料顆粒和雜質(zhì)，在1.5 m L離心管內(nèi)加入1 m L離心上清液，再次離心(10 000 r/m in，10 m in)，去除樣品中蛋白質(zhì)沉淀物，取上清液待用。

1.5.3.2 色譜條件

汽化室參數(shù):載氣為N2，分流比40∶1，進(jìn)樣量0.4μL，溫度 220 ℃;色譜柱參數(shù):HP-INNOW ax毛細(xì)管色譜柱恒流模式，流量2.0 m L/min，平均線速度38 cm/s;柱溫箱參數(shù):程序升溫120℃(3 m in)—10℃/m in—180℃(1 m in);檢測(cè)器參數(shù):H2流量40 m L/m in，空氣流量450 m L/m in，柱流量+尾吹氣流量45 m L/m in，氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)溫度250℃。

1.5.4 氣樣成分的檢測(cè)

用島津GC－14C氣相色譜儀測(cè)定［13］。色譜條件為檢測(cè)器:熱導(dǎo)檢測(cè)器(TCD);色譜柱:填充柱TDX－01;測(cè)定條件:柱溫 150℃，檢測(cè)器180℃，進(jìn)樣口溫度 180℃，載氣為 N2，流速30 m L/m in，進(jìn)樣量200μL。測(cè)定氣袋收集的氣體中甲烷含量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有數(shù)據(jù)經(jīng)Excel整理后，采用SAS 9.1軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，并用混合模型(m ixed procedure)進(jìn)行多重比較，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 飼糧中添加海南霉素對(duì)奶牛瘤胃發(fā)酵模式的影響

2.1.1 飼糧中添加海南霉素對(duì)奶牛瘤胃pH的影響

由表2可見，與負(fù)對(duì)照組相比，海南霉素和莫能菌素只在采食后2 h顯著提高了奶牛瘤胃內(nèi)pH(P ＜0.05)，其余時(shí)間影響均不顯著(P ＞0.05)。各組試驗(yàn)牛的瘤胃pH都呈現(xiàn)相似的變化趨勢(shì)，即采食后pH開始逐漸下降，降至最低點(diǎn)后緩慢上升，到飼喂后10 h pH基本接近飼喂前水平。在整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)，各組試驗(yàn)牛的瘤胃pH維持在6.38～6.69。

表2 飼糧中添加海南霉素對(duì)奶牛瘤胃pH動(dòng)態(tài)變化的影響Table 2 Effects of dietary hainanmycin on dynam ic changes of rumen pH in dairy cows

2.1.2 飼糧中添加海南霉素對(duì)奶牛瘤胃內(nèi)NH3-N濃度的影響

由表3可見，各組NH3-N濃度在飼喂后2 h達(dá)到最高值，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，NH3-N濃度先下降后上升。在采食后0、2、8、10 h，海南霉素組和正對(duì)照組的NH3-N濃度均顯著低于負(fù)對(duì)照組(P＜0.05);在采食后6 h，海南霉素和莫能菌素均有抑制NH3-N釋放的趨勢(shì)，但差異不顯著(P=0.06)。

表3 飼糧中添加海南霉素對(duì)奶牛瘤胃NH 3-N濃度動(dòng)態(tài)變化的影響Table 3 Effects of dietary hainanm ycin on dynam ic changes of rumen ammonia concentration in dairy cows mg/dL

2.1.3 飼糧中添加海南霉素對(duì)奶牛瘤胃內(nèi)VFA的影響

由表4可知，海南霉素和莫能菌素對(duì)瘤胃總揮發(fā)性脂肪酸濃度的影響不顯著(P＞0.05);海南霉素組和正對(duì)照組的奶牛在采食后0、2、4和6 h，乙酸濃度及乙酸與丙酸的比值都顯著低于負(fù)對(duì)照組(P＜0.05)，丙酸濃度顯著高于負(fù)對(duì)照組(P＜0.05)，但在采食后8 h，以上指標(biāo)均無顯著差異(P＞0.05)，在采食后10 h，除海南霉素組丙酸濃度比負(fù)對(duì)照組顯著提高外(P＜0.05)，其他指標(biāo)均無顯著影響(P＞0.05);除采食后0 h，莫能菌素顯著降低了丁酸濃度(P＜0.05)外，海南霉素和莫能菌素對(duì)瘤胃內(nèi)丁酸濃度無顯著影響(P＞0.05)。

表4 飼糧中添加海南霉素對(duì)奶牛瘤胃VFA濃度動(dòng)態(tài)變化的影響Table 4 Effects of dietary hainanm ycin on dynam ic changes of volatile fatty acid(VFA)concentration in rumen of dairy cows

2.2 飼糧中添加海南霉素對(duì)奶牛瘤胃甲烷產(chǎn)量的影響

從表5可以看出，3個(gè)組的甲烷排放量以負(fù)對(duì)照組最高為251.83 L/d，海南霉素組和正對(duì)照組顯著低于負(fù)對(duì)照組(P＜0.05)，分別比負(fù)對(duì)照組降低14.03%和16.98%，但二者之間無顯著差異

(P＞0.05)。甲烷排放損失的能量與每天甲烷的產(chǎn)生量有相同的變化趨勢(shì)，負(fù)對(duì)照組甲烷排放損失的能量最多，占奶牛攝入能量的7.63%，而海南霉素組和正對(duì)照組分別比負(fù)對(duì)照組降低13.50%和16.64%。每采食1 kg干物質(zhì)的甲烷排放量(L/DM I)以負(fù)對(duì)照組最高為34.06 L，海南霉素組居中為 29.46 L，正對(duì)照組最少為28.39 L，海南霉素組和正對(duì)照組之間差異不顯著(P＞0.05)，與負(fù)對(duì)照組差異顯著(P＜0.05)。

表5 飼糧中添加海南霉素對(duì)奶牛瘤胃甲烷產(chǎn)量的影響Table 5 Effects of dietary hainanmycin on rumen methane production of dairy cow s

3 討論

3.1 飼糧中添加海南霉素對(duì)奶牛瘤胃發(fā)酵模式的影響

3.1.1 飼糧中添加海南霉素對(duì)奶牛瘤胃 pH的影響

相對(duì)穩(wěn)定的瘤胃內(nèi)環(huán)境是瘤胃微生物發(fā)揮正常功能的必要條件，pH的高低均可影響瘤胃微生物的生長(zhǎng)、發(fā)育和發(fā)酵類型。盧德勛［14］指出促進(jìn)纖維消化的適宜瘤胃液pH范圍為6.0～6.8，低于6.2時(shí)，纖維分解菌的生長(zhǎng)就會(huì)受到抑制。本試驗(yàn)?zāi)膛Ｔ陲曃购?0 h內(nèi)，瘤胃pH變化范圍為6.38～6.69，均處于正常值范圍內(nèi)。并且在飼喂后2 h，海南霉素組和莫能菌素組的瘤胃pH都顯著高于負(fù)對(duì)照組，這說明海南霉素與莫能菌素相似均能減緩瘤胃pH的降低，這與先前的體外試驗(yàn)結(jié)果相似［8］;同時(shí)，有研究表明，在高精料飼糧條件下，莫能霉素通過影響VFA的濃度來改變瘤胃pH，在一定程度可緩解高峰期奶牛飼喂高精料飼糧造成的酸中毒［15］;李炯明［16］指出，海南霉素可以提高山羊瘤胃液的pH，本研究表明海南霉素只在采食后2 h pH高于負(fù)對(duì)照組，海南霉素對(duì)奶牛瘤胃pH的影響與對(duì)山羊瘤胃pH的影響有一定的不同。

3.1.2 飼糧中添加海南霉素對(duì)奶牛瘤胃內(nèi)NH3-N的影響

反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)的NH3-N是瘤胃內(nèi)飼料蛋白質(zhì)、內(nèi)源性蛋白質(zhì)和非蛋白氮等分解的終產(chǎn)物，在能量和碳源充足的情況下，它是瘤胃微生物合成菌體蛋白質(zhì)的主要氮源［17］。從本試驗(yàn)的結(jié)果來看，海南霉素與莫能菌素均顯著降低了瘤胃中NH3-N的濃度，這與李炯明等［8］的體外試驗(yàn)結(jié)果相一致，也與李炯明［16］和任明強(qiáng)等［18］的試驗(yàn)中海南霉素對(duì)山羊瘤胃發(fā)酵的影響的結(jié)果一致。Whetstone等［19］在閹公牛飼糧中加入33 mg/kg的莫能菌素可顯著增加過瘤胃蛋白質(zhì)的量，氨氣產(chǎn)生量也大幅度減少。Martineau等［20］也發(fā)現(xiàn)莫能菌素能降低瘤胃NH3-N的濃度，提高粗蛋白質(zhì)的消化率。離子載體能減少瘤胃中氨的產(chǎn)生，增加非NH3-N的產(chǎn)量，部分原因是一些產(chǎn)氨菌對(duì)離子載體敏感并受到抑制，其產(chǎn)氨作用受到限制［21］。

本試驗(yàn)中各組NH3-N的濃度先升高，然后緩慢降至最低，最后又略有升高，由于在采食后，飼料消化產(chǎn)生大量的NH3-N，致使其濃度迅速上升至最高，但隨著瘤胃微生物的利用，NH3-N的濃度逐漸降低至最低，之后又開始上升，可能是因?yàn)楫?dāng)NH3-N的濃度降到一定程度時(shí)，不足以維持瘤胃細(xì)菌的生長(zhǎng)和維持，使其發(fā)生自身裂解，釋放出一些NH3-N，所以使NH3-N的濃度又略有回升。

3.1.3 飼糧中添加海南霉素對(duì)奶牛瘤胃內(nèi)VFA的影響

VFA的產(chǎn)量和組成比例是評(píng)述瘤胃發(fā)酵方式和發(fā)酵能力的直接指標(biāo)。VFA是反芻動(dòng)物能量利用的主要形式，其主要由乙酸、丙酸和丁酸組成。其中丙酸在VFA中所占比例對(duì)反芻動(dòng)物生產(chǎn)性能有重要影響［8］。在本試驗(yàn)中，海南霉素和莫能菌素均降低了乙酸濃度，增加了丙酸生成，使瘤胃發(fā)酵趨向于丙酸型發(fā)酵，卻沒有改變總揮發(fā)性脂肪酸的濃度，這與李新建等［22］、Guan 等［23］和歐宇等［24］報(bào)道的結(jié)果一致，其原因是莫能菌素改變了瘤胃微生物區(qū)系，主要是產(chǎn)乙酸的革蘭氏陽性菌特異性減少，產(chǎn)丙酸的革蘭氏陰性菌數(shù)量增加，從而導(dǎo)致了較高的丙酸與乙酸的比例［11］;李炯明［16］和任明強(qiáng)等［18］的試驗(yàn)結(jié)果表明海南霉素可降低山羊瘤胃乙酸濃度，提高丙酸濃度，降低乙酸與丙酸的比值，本試驗(yàn)結(jié)果與以上結(jié)果相同。

3.2 飼糧中添加海南霉素對(duì)奶牛瘤胃甲烷產(chǎn)量的影響

甲烷的產(chǎn)生主要來源于瘤胃發(fā)酵，它由瘤胃碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生的CO2和H2所合成。甲烷的產(chǎn)生和排放既會(huì)加劇溫室效應(yīng)又會(huì)造成飼料能量的浪費(fèi)。因此，降低瘤胃甲烷的生成非常重要，本試驗(yàn)結(jié)果表明，在奶牛飼糧中添加海南霉素可以顯著降低甲烷的生成，且與莫能菌素相比，二者在抑制甲烷生成上沒有差異。眾多報(bào)道表明，莫能菌素能顯著降低反芻動(dòng)物瘤胃甲烷的生成［25－27］。莫能菌素抑制瘤胃中甲烷產(chǎn)生的原因有以下2點(diǎn)，其一是它使瘤胃發(fā)酵趨向于丙酸型發(fā)酵，丙酸的生成競(jìng)爭(zhēng)性地消耗了甲烷生成的前體物質(zhì)CO2和H2，隨著丙酸的增加，合成甲烷的前體物質(zhì)減少，從而間接減少了甲烷的生成［28－29］;其二是它通過抑制瘤胃中產(chǎn) CO2和 H2的細(xì)菌，減少了生成甲烷的主要反應(yīng)物，從而間接抑制甲烷的產(chǎn)生［30］。

本試驗(yàn)中，海南霉素顯著降低了甲烷的產(chǎn)生量，因而也顯著降低了甲烷排放損失的能量，顯著提高了能量的利用率。

4 結(jié)論

①飼糧中添加海南霉素使奶牛的瘤胃發(fā)酵類型更趨向于丙酸型發(fā)酵。

②飼糧中添加海南霉素能顯著降低奶牛甲烷的產(chǎn)量，有效地提高了能量的利用率。

［1］ JOHSON D E，HILL T M，CARMEAN B R，et al.New perspectives rum inantmethane em issions［M］//WENK C，BOESSINGER M.Energy metabolism of farm animal.Sw itzerland:EAAP Publication，1991:376－379.

［2］ JOHSON K A，JOHSON D E.Methane em issions from cattle［J］.Journal of Animal Science，1995，73(8):2483－2492.

［3］ GOODRICH R D，GARRETT J E，GAST D R，et al.Influence of monensin on the performance of cattle［J］.Journal of Animal Science，1984，58(6):1484－1485.

［4］ 寧豫昌，陳忠杰，郭宏偉，等.莫能菌素的應(yīng)用現(xiàn)狀［J］.鄭州牧業(yè)工程高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào)，2007，27(3):21－24.

［5］ 陳杰，陸天水，朱祖康.海南霉素調(diào)控反芻動(dòng)物消化代謝提高生產(chǎn)性能的研究［G］//動(dòng)物生理生化學(xué)分會(huì)第八次學(xué)術(shù)會(huì)議暨全國反芻動(dòng)物營養(yǎng)生理生化第三次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要匯編.長(zhǎng)春:中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物生理生化學(xué)分會(huì)，2004:6.

［6］ 沈贊明，陳杰，任明強(qiáng).海南霉素對(duì)山羊瘤胃內(nèi)肽的保護(hù)作用［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，27(4):73－76.

［7］ M INGQIANG R，ZANM ING S，RUQIAN Z，et al.Effects of novel polyether ionophore hainanmycin on nutrient digestion，metabolism and rum inal characteristics of goats［J］.Journal of Animal and Feed Sciences，1998，7(1):21－28.

［8］ 李炯明，莊蘇，王恬，等.海南霉素對(duì)人工瘤胃體外發(fā)酵調(diào)控的影響［J］.家畜生態(tài)學(xué)報(bào)，2007，28(1):41－46.

［9］ 韓興泰，謝敖云，胡令浩.牦牛甲烷氣的產(chǎn)量［J］.動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，1996，8(2):62.

［10］ 韓永樣，石永春，姜宗堯，等.黑白花奶牛生長(zhǎng)期能量代謝測(cè)試初報(bào)［J］.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1982(4):11－18.

［11］ ODONGO N E，BAGG R，VESSIE G，et al.Longterm effects of feeding monensin on methane production in lactating dairy cows［J］.Journal of Dairy Science，2007，90(4):1781－1788.

［12］ ERW IN E S，MARCO G J，EMERY E M.Volatile fatty acid analyses of blood and rumen fluid by gas chromatography［J］.Journal of Dairy Science，1961，44(9):1768－1771.

［13］ 張?jiān)獞c，魏吉安，孟慶翔.不同植物細(xì)胞壁的體外發(fā)酵特征及其對(duì)甲烷產(chǎn)生的貢獻(xiàn)［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006，37(10):992 －998.

［14］ 盧德勛.系統(tǒng)動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)導(dǎo)論［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2004:132－133.

［15］ 歐宇，李勝利.莫能霉素對(duì)反芻動(dòng)物的影響［N］.中國畜牧獸醫(yī)報(bào)，2008－10－7(7).

［16］ 李炯明.海南霉素和Nisin對(duì)瘤胃體外發(fā)酵及山羊瘤胃體內(nèi)發(fā)酵的影響［D］.碩士學(xué)位論文.南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006:47－59.

［17］ 張永根.瘤胃脈酶抑制劑氫醒對(duì)反芻動(dòng)物作用的研究［D］.博士學(xué)位論文.哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2001:42.

［18］ 任明強(qiáng)，沈贊明，趙茹茜，等.不同濃度海南霉素對(duì)山羊瘤胃消化代謝的影響［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，21(3):76 －79.

［19］ WHETSTONE H D，DAVIS C L.Effect of monensin on breakdown of protein by rum inal m icroorganisms in vitro［J］.Journal of Animal Science，1983，53(3):803－807.

［20］ MARTINEAU R，BENCHAAR C，PETIT H V，et al.Effects of lasalocid or monensin supplementation on digestion，rum inal fermentation，blood metabolites and m ilk production of lactating dairy cows［J］.Journal of Dairy Science，2007，90(12):5714 －5725.

［21］ RUSSELL J B，ROBINSON P H.Com position and characteristics of strains of streptococcus bovis［J］.Journal of Dairy Science，1984，67(7):1525 －1531.

［22］ 李新建，高騰云.影響瘤胃內(nèi)甲烷氣產(chǎn)量的因素及其控制措施［J］.家畜生態(tài)，2002，23(4):67 －69.

［23］ GUAN H，W ITTENBERG K M，OM INSKI K H，et al.Efficacy of ionophores in cattle diets form itigation of enteric methane［J］.Journal of Animal Science，2006，84(7):1896－1906.

［24］ 歐宇，李勝利.莫能霉素在反芻動(dòng)物中的應(yīng)用［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2003，30(2):18 －20.

［25］ TEDESCHIL O，F(xiàn)OX D G，TYLUT T P.Potential environmental benefits of ionophores in rum inant diets［J］.Journal of Environment Quality，2003，32(5):1591－1602.

［26］ DELLINGER C A，F(xiàn)ERRY JG.Effect of monensin on grow th and methanogenesis of methanobacterium form icicum［J］.Applied and Environmental M icrobiology，1984，48(3):680－682.

［27］ MCGINN SM，BEAUCHEM IN K A，COATES T，et al.Methane em issions from beef cattle:effects of monensin，sunflower oil，enzymes，yeast，and fumaric acid［J］.Journal of Animal Science，2004，82(11):3346－3356.

［28］ BHATTA R，UYENO Y，TAJIMA K，et al.Difference in the nature of tannins on in vitro rum inalmethane and volatile fatty acid production and onmethanogenic archaea and protozoal populations［J］.Journal of Dairy Science，2009，92(11):5512－5522.

［29］ VAN KESSEL JA S，RUSSELL JB.The effect of pH on rum inalmethanogenesis［J］.FEMSM icrobiology Ecology，1996，20(4):205－210.

［30］ CHEN M，WOLIN M J.Effect of monensin and lasalocid-sodium on the grow th ofmethanogenic and rumen saccharolytic bacteria［J］.Applied and Environmental M icrobiology，1979，38(1):72－77.