孫天宇，楊宏志

（黑龍江八一農墾大學食品學院，大慶163319）

沙棘（Hippophae rham noides Linn.）為胡頹子科植物，落葉灌木，它屬一種雌雄異株的落葉性灌木或小喬木。耐寒冷，耐干旱適應性強，中國是沙棘資源最豐富的國家，占世界沙棘總面積的95%，在這種情況下，合理開發(fā)沙棘資源，提高沙棘資源的附加值具有重要的意義[1]。

黃酮類化合物（navonoids），它主要存在于沙棘的所有部位—根、莖、葉、花和果實中。黃酮是人體必需營養(yǎng)素，因其具有抗癌、抗氧化的作用且直接來源于天然的植物，專家預測沙棘黃酮類的系列保健產品很快會風靡全世界[2]。

響應面分析法是一種通過分析回歸方程、擬合因素和響應值之間的函數關系的一種統(tǒng)計方法，與其他分析方法比較，它具有精度高，試驗次數少，可充分體現多種因素交互作用的特點。因此，響應面分析法已經被廣泛應用于生產和科研等領域[3]。

1 材料與方法

1.1 材料

沙棘葉是由黑龍江省農科院植保所提供的；蘆丁標準品（成都思科華生物技術有限公司）；石油醚、乙醇、氫氧化鈉等（北京化工廠）試劑均為分析純。

1.2 儀器

AR2140型分析天平（梅特勒-托利多（上海）有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（上海森信實驗儀器有限公司）；紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；TGL-16G飛鴿離心機（上海安亭科學儀器廠）；R-201型旋轉蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），索氏提取器，電熱鼓風干燥箱，C型超聲波藥品處理機（濟寧金百特電子有限公司）。

1.3 主要方法

1.3.1 原料的預處理

新鮮的沙棘葉干燥粉粹后過80目篩子，用石油醚在索氏提取器中脫脂，除去脂肪及油溶性雜質。

1.3.2 標準溶液的配制及標準曲線的繪制

準確稱取經105℃干燥至恒重的蘆丁標準品0.027 1 g，加適量甲醇溶解移至容量瓶并定容至100 mL，搖勻備用。從中再吸取5 mL，置于25 mL容量瓶中，甲醇定容，從中準確吸取標準溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0與6.0 mL分別置于10 mL容量瓶中，加水約6 mL，加5%三氯化鋁甲醇溶液1 mL，加甲醇定容至刻度，搖勻，放置10 min，用紫外分光光度計在433 nm波長處測定吸光度。以吸光度A為縱坐標，蘆丁濃度C為橫坐標，繪制標準曲線，用最小二乘法進行線性回歸[4]。得回歸方程:

此方程的相關系數r=0.999 6。

總黃酮得率（mg·g-1）=提取的黃酮質量/沙棘葉中黃酮的總質量。

1.3.3 樣品中總黃酮的提取及測定

準確稱取1.000 0 g經干燥粉碎并脫脂后的沙棘葉樣品放入具塞三角瓶中，加入一定體積分數的乙醇溶液，按照相應的條件在超聲中進行提取，抽濾，濃縮后用甲醇定容于100 mL容量瓶中待用，吸取樣品溶液1 mL置于10 mL容量瓶中，以沒有加樣品的溶液作為空白，按上述方法測定黃酮質量分數，帶入回歸方程，求得樣液中總黃酮的量[5]。最終計算出黃酮的得率。

1.4 黃酮的提取

采用有機溶劑浸提法提取沙棘葉中的總黃酮，其提取率受有機溶劑種類及體積分數、提取溫度、提取時間、液固比等因素影響，分別進行單因素試驗[6]。準確稱取一定量脫脂后的沙棘葉，分別在不同條件下提取，提取液抽濾后用旋轉蒸發(fā)儀蒸干，統(tǒng)一定容后按1.3中的方法進行測定。

1.5 提取條件優(yōu)化

在最佳單因素試驗條件的基礎上用SAS9.2軟件設計響應面試驗，對結果進行響應面回歸和方差分析，對提取條件進行優(yōu)化。得出最佳提取條件。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇體積分數對總黃酮提取率的影響

通過前期的準備實驗可知黃酮類化合物是溶于甲醇、乙醇等有機溶劑的，因為乙醇具有無毒、滲透性強、浸出率高且對酶有抑制作用等特點，所以用乙醇作為提取沙棘葉中總黃酮的有機溶劑時效果最好，最終選用乙醇作為提取的有機溶劑[7]，分別采用體積分數為45%、55%、65%、75%、85%、95%的乙醇為提取溶劑，結果如圖所示：

圖1 乙醇濃度對黃酮得率的影響Fig.1 The effect of ethanol thickness on tatle flavanone

從圖1可以看出，總黃酮的提取率隨著乙醇體積分數的增加先升高后又降低，用SAS9.2分析得出P＜0.000 1，影響極顯著，乙醇濃度為75%的時候總黃酮的提取率最高，乙醇濃度的升高會使樣品中的一些其他脂溶性物質相繼溶解出來，從而影響了黃酮類物質的浸出。

2.1.2 溫度對總黃酮提取率的影響

準確稱取1.000 8 g經干燥粉碎脫脂后的沙棘葉樣品，與體積分數為75%的乙醇溶液混合，在料液比為1∶25，超聲功率為400 W的條件下，分別為35、45、55、65、75和85℃時，提取30 min[8]，每次重復做2個平行實驗，結果如圖所示：

圖2 提取溫度對黃酮得率的影響Fig.2 The effect of extraction temperature on tatle flavanone

由圖2可見，在其他條件相同的情況下，經測定黃酮的提取率隨提取溫度的升高而增加，當溫度達到55℃時黃酮得率最高，以后不再增加甚至開始下降，這是由于當溫度升高時樣品中的黃酮類化合物會發(fā)生氧化，經SAS9.2方差分析得P=0.064，影響不顯著，但是考慮提取條件的經濟實用性，所以最適提取溫度確定為55℃。

2.1.3 超聲時間對總黃酮提取率的影響

準確稱取1.000 3 g經干燥粉碎脫脂后的沙棘葉樣品，加入75%的乙醇并以1∶25的料液比混勻，在55℃的溫度，超聲功率為400 W的條件下，考察分別提取10、20、30、40、50和60 min的時候，總黃酮的提取率，每次重復做2個平行實驗，結果如圖3所示。

圖3 提取時間對黃酮得率的影響Fig.3 The effect of extract time on tatle flavanone

由圖3可見，超聲時間在10～60 min之間，黃酮得率隨著超聲時間的延長而提高，在超聲時間為30 min時黃酮得率達到最高，30 min之后效果開始下降，其原因可能是在長時間的超聲作用下黃酮母核被破壞，導致黃酮得率降低[9]。經SAS9.2進行單因素方差分析，得P=0.001，即在α=0.01水平上超聲時間對沙棘葉中總黃酮的得率影響顯著，所以選擇30 min作為最佳超聲時間。

2.1.4 超聲功率對總黃酮提取率的影響

超聲波是高速震蕩，增加組織內部能量使細胞快速破裂從而讓細胞中物質迅速釋放和擴散，且不改變天然物質的性質，選擇超聲功率在200、300、400、500、600和700 W時，考察黃酮類化合物的提取率，結果如圖所示：

圖4 超聲功率對黃酮得率的影響Fig.4 The effect of ultrasonic on tatle flavanone

由圖4可見，超聲功率在200～700 W總黃酮得率在500 W時達到最高，之后隨著功率的增加黃酮提取率無變化甚至稍有下降，經SAS9.2進行單因素方差分析，得P=0.001，即在α=0.01水平上超聲功率對沙棘葉中總黃酮的得率影響顯著，因此選擇500 W作為最佳超聲條件。分析原因可能是隨著超聲波功率的提高，熱效應、空化效應和機械作用隨之加強，更有利于細胞中物質的釋放和擴散，當功率達到500 W時達到黃酮含量最大值，不再隨著功率增加而增大。

2.1.5 料液比對總黃酮提取率的影響

準確稱取1.000 2 g經處理后的沙棘葉樣品與75%的乙醇溶液混合，在溫度為55℃，超聲功率500 W，超聲處理30 min，并以1∶5、1∶15、1∶25、1∶35、1∶45和1∶55的各條件下得出總黃酮的提取率，每次重復做2個平行實驗，結果如圖所示：

圖5 料液比對黃酮得率的影響Fig.5 The effect of different liquor thickness on tatle flavanone

由圖5可見，提取時的料液比在1∶5～1∶55的試驗范圍之內隨著料液比的增加，黃酮得率增大，在1∶35得率最高，在實際操作中，用SAS9.2對結果進行單因素方差分析，P＜0.000 1即在α=0.01水平上，料液比對總黃酮的提取率影響極顯著，因此選擇料液比為1∶35作為最佳提取條件。

2.2 提取條件的優(yōu)化

2.2.1 響應面法優(yōu)化超聲波提取沙棘葉中總黃酮的工藝

在單因素的基礎上，用SAS9.2軟件進行響應面試驗設計，選擇4因素3水平的Box-Behnken設計，測定不同提取時間、乙醇體積分數、液固比、超聲功率條件下的沙棘葉中總黃酮的得率[10]。因素與水平設計及見表1。

2.2.2 結果與分析

為考察各因素對黃酮得率的影響，根據表3中實驗結果，以黃酮得率為指標，利用SAS 9.2數據處理系統(tǒng)對實驗結果進行多元回歸分析，結果見表4。

表1 因素水平編碼表Table 1 Factors and their coded levels in central composite table

表2 二次回歸旋轉組合設計及實驗結果Table 2 Quadratic regression orthogonal rotation combination design and test results

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance for the established regression model

表3說明二次回歸模型的F值為25.02，大于F(14，12)0.01=4.05，且P值＜0.000 1，而失擬性的F值為38.10，小于F(10，2)0.01=99.39，說明該模型的擬和結果好。決定系數R2=0.966 9一次項，二次項F值均大于0.01水平上的F值，說明各個因素對黃酮得率有極其顯著的影響，而交互項大于0.01水平上的F值，說明各個因素之間的交互作用對黃酮得率有顯著影響。

表4 回歸方程系數t檢驗方差分析Table 4 T-test analysis of variance of each coefficient in the established regression model

由表4檢驗方差分析得，各因素對沙棘總黃酮得率的影響程度從大到小的順序依次為：乙醇的體積分數（X1），超聲功率（X3），料液比（X4），提取時間（X2）。

通過SAS9.2數據統(tǒng)計分析軟件進行回歸分析，得二次回歸方程為：

Y1=-268.164 167+4.485 333X1+1.237 000X2+ 0.101 183X3+3.394 000X4-0.023 767X12+0.007 200X1X2-0.000 480X1X3-0.023 000X1X4-0.024 967X22-0.000 565X2X3+0.001 900X2X4-0.000 024 292X32-0.000 560X3X4-0.019 417X42

通過超聲波法提取沙棘葉總黃酮的四因素三水平的設計優(yōu)化工藝，SAS9.2統(tǒng)計分析軟件分析，試驗結果見表5：

表5 響應面法優(yōu)化結果的驗證實驗結果Table 5 The results of verification test of response surface methods

由表5可知，以沙棘葉總黃酮的得率為響應值，由中心組合設計結果分析后，根據實際條件，可確定的達到總黃酮得率最大值的最優(yōu)組合為：乙醇濃度76.04%，超聲時間30.7 min，超聲功率561.5 W，料液比1∶36。得出提取黃酮得率為10.49 mg·mL-1。在響應面法所預測的理論最佳提取條件下做三次驗證實驗，得出提取黃酮得率平均值為10.51 mg·mL-1。實測的均值與理論值誤差小于5%，說明回歸方程擬合性良好。

3 結論

目前，沙棘葉總黃酮的提取方法主要有水提法、有機溶劑提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法和超臨界流體萃取法。超聲波輔助提取法提取效率高，提取時間短[11]。本研究以乙醇溶液為提取劑提取沙棘葉總黃酮，并用響應面設計法進行優(yōu)化，最佳提取條件為:超聲功率為561.5 W，乙醇體積分數為76.04%，超聲時間為30.7 min，料液比為1∶36，黃酮得率為10.51 mg·mL-1。同其他方法比較，此方法設備簡單，成本低，見效快，適于工業(yè)化生產。經響應面設計法優(yōu)化后，可以找到各因素的最佳值并獲得較理想的得率;同時，各個因素間的相互作用對生產過程中工藝參數的設置提供了參考[12]。對實際生產更有指導意義，在生產和科研中必將有著廣闊的應用前景。

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