尹立影，張永忠

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院應(yīng)用化學(xué)系，黑龍江 哈爾濱 150030)

紅三葉(Trifoliumpratense)主要活性成分是紅三葉異黃酮。紅三葉中的異黃酮有近40多種[1]，主要的4種異黃酮分別為芒柄花黃素(Formononetin)、雞豆黃素(Biochanin A)、染料木黃酮(Genistein)和黃豆苷元(Daidzein)[2-5]。前兩種異黃酮含量相對較高，據(jù)報(bào)道紅三葉中芒柄花黃素含量為9. 65 mg·g-1，雞豆黃素含量為10.22 mg·g-1[3]。一般大豆(Glycinemax)中異黃酮含量0.50～1.70 mg·g-1[6]，紅三葉中總異黃酮含量是其他豆科植物的10～30倍[7]，遠(yuǎn)高于大豆中大豆異黃酮含量[8]。紅三葉中含有的異黃酮主要以糖苷的形式存在，采摘后由于酶解或水解反應(yīng)主要以苷元形式存在[9]。紅三葉異黃酮有消炎[10]、抗癌[11]、抗腫瘤[12]、調(diào)節(jié)人體激素平衡、改善骨質(zhì)疏松、緩解婦女更年期綜合癥[12]、防治高膽固醇血癥、抗氧化、清除自由基、預(yù)防紫外線[13]等作用。紅三葉生長季節(jié)長，分布廣泛，產(chǎn)量高，而且重復(fù)修剪能刺激紅三葉中異黃酮含量的增加[7]。紅三葉異黃酮可從葉、莖、花中提取，而大豆異黃酮只能從大豆種子中提取。種植大豆需要優(yōu)質(zhì)的耕地，而紅三葉對土壤的要求不高，可以不占用糧食資源和優(yōu)質(zhì)土地，因此，紅三葉是獲取異黃酮重要的可再生生物資源。

亞臨界水又稱熱液態(tài)水、高壓熱水或過熱水[14]。亞臨界水提取法(Subcritical Water Estraction，SWE)是近期國內(nèi)外較流行的一種提取方法，具有節(jié)省提取時(shí)間、萃取效率高、對環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。其在高熱高壓下處理且不使用酸、堿和催化劑，用水作為溶劑，沒有有機(jī)溶劑殘留，能保留提取物不被氧化、活性不被破壞[15]，因此，也被稱為“綠色的處理法”。利用亞臨界水法提取紅三葉中總異黃酮的研究在國內(nèi)還未見報(bào)道，因此，本研究可為紅三葉的工業(yè)應(yīng)用提供價(jià)值。

1 材料與方法

1.1材料與儀器 紅三葉來源于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝站，室外種植，于花蕾期采全株，將其烘干后用高速萬能粉碎機(jī)粉碎(FW型，天津市泰斯特儀器有限公司)。

純品的芒柄花黃素和雞豆黃素由Fluka公司生產(chǎn)，純度99%；高純氮?dú)猓徸员本┦衼喣蠚怏w有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.999%。

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)、METTLER TOLEDO AG135型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)、LG10-2 4A型高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、高壓磁力攪拌反應(yīng)釜(煙臺高新區(qū)科立自控設(shè)備研究所)和真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海醫(yī)械專機(jī)廠有限公司)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1紫外分光光度法測定紅三葉總異黃酮的含量 依據(jù)文獻(xiàn)[16]測定紅三葉總異黃酮的含量，紅三葉異黃酮中主要含有芒柄花黃素和雞豆黃素。取等比例芒柄花黃素和雞豆黃素的混合溶液，用乙醇分別配制成總質(zhì)量濃度為0、2、4、6、8 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在253.5 nm下測定混合溶液吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2紅三葉總異黃酮得率的計(jì)算

1.3紅三葉異黃酮的亞臨界水提取 將采回的紅三葉全株烘干，經(jīng)高速萬能粉碎機(jī)粉碎，過0.45 mm篩備用。準(zhǔn)確稱取紅三葉草粉4.000 0 g放入高壓反應(yīng)釜中，根據(jù)液固比例加入所需體積的蒸餾水，通入高純氮?dú)饧訅海帕嚢杷俣葹?60 r·min-1，進(jìn)行亞臨界水提取試驗(yàn)。

在以下4種條件下進(jìn)行提取試驗(yàn)：1)在液固比、提取壓力、提取溫度分別為80 mL·g-1、0.8 MPa、120 ℃條件下，選取提取時(shí)間10、20、30、40和50 min進(jìn)行提取試驗(yàn)；2)在液固比、提取時(shí)間、提取壓力分別為80 mL·g-1、20 min、0.8 MPa條件下，選擇提取溫度為100、110、120、130、140 ℃進(jìn)行提取試驗(yàn)；3)在提取時(shí)間、提取壓力、提取溫度分別為20 min、0.8 MPa、120 ℃條件下，選擇水與紅三葉草粉的液固比為40、50、60、70、80 mL·g-1進(jìn)行試驗(yàn)提??；4)在提取時(shí)間為20 min、提取溫度為120 ℃、液固比為50 mL·g-1的條件下，選擇壓力為1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 MPa進(jìn)行試驗(yàn)提取。

提取液用熱水漏斗趁熱過濾，用乙醇定容適量提取液，按參考文獻(xiàn)[16]在波長253.5 nm處測定其吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算所得提取液中總異黃酮的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1提取時(shí)間對紅三葉總異黃酮提取效果的影響 當(dāng)提取時(shí)間為20～30 min時(shí)，異黃酮得率明顯升高，在30 min以后異黃酮得率有下降趨勢。因此，最佳提取時(shí)間為20 min(圖1)。

2.2提取溫度對紅三葉總異黃酮提取效果的影響 開始升溫時(shí)，異黃酮得率隨溫度的升高而增大，當(dāng)提取溫度為120 ℃時(shí)，異黃酮的得率最高，隨后下降(圖1)。因此，120 ℃為單因素提取的最佳溫度條件。

2.3液固比對紅三葉總異黃酮提取效果的影響 當(dāng)液固比為50 mL·g-1時(shí)，紅三葉總異黃酮的得率最大(圖1)。試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，若液固比過小會有糊底現(xiàn)象發(fā)生；若液固比過大，會給后續(xù)純化造成一定困難和不必要的能源浪費(fèi)。因此，最佳液固比為50 mL·g-1。

2.4提取壓力對紅三葉異黃酮提取效果的影響 在1.0～1.4 MPa壓力范圍內(nèi)，紅三葉總異黃酮提取率隨提取壓力的增大而增大。當(dāng)壓力為1.4 MPa時(shí)，紅三葉總異黃酮提取率最高，而后下降(圖1)。因此，1.4 MPa為最佳提取壓力。

2.5亞臨界水提取紅三葉中總異黃酮的正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對影響亞臨界水提取紅三葉中總異黃酮的各因素進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)，得出結(jié)果后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，確定其工藝的最佳參數(shù)。

圖1 提取時(shí)間、提取溫度、液固比和提取壓力對異黃酮提取效果的影響Fig.1 Influence of time，tempreture，liquid to solid ratio and pressure on isoflavone extraction

由極差分析結(jié)果可以看出，對紅三葉總異黃酮提取效率影響的主要因素依次為B>C>A>D，即溫度影響相對較大，其次為液固比、提取時(shí)間和提取壓力。研究得到最佳組合為A1B2C1D2，即15 min、120 ℃、40 mL·g-1、1.4 MPa(表2)。

2.6驗(yàn)證試驗(yàn) 取紅三葉草粉4.000 0 g，按照最佳工藝即15 min、120 ℃、40 mL·g-1、1.4 MPa條件進(jìn)行試驗(yàn)，總異黃酮得率為33.61 mg·g-1，高于正交試驗(yàn)中的最大值，表明本試驗(yàn)所得出的最佳工藝為最佳提取條件。

表1 因素與水平Table 1 Factors and levels

表2 L9(34)設(shè)計(jì)Table 2 L9(34)Designandresultsof L9(34)orthogonal test

3 討論與結(jié)論

溫度越高分子運(yùn)動速度越快，但長時(shí)間的高溫可能會導(dǎo)致異黃酮的分解，或者由于紅三葉中蛋白質(zhì)變性形成的沉淀將原料包裹起來[17]，降低異黃酮的提取率，其具體原因有待于深入研究。加壓提取與傳統(tǒng)的加熱回流提取相比提取效果更好。加壓是液體介質(zhì)在壓力作用下的傳遞過程，不論提取物質(zhì)是固體還是液體，都可受到均一的壓力作用。通過升高溫度和壓力，增強(qiáng)溶劑對原料顆粒的穿透能力，從而加速溶劑的擴(kuò)散，提高浸出速度和浸出率。同時(shí)，高壓還能使溶劑在高于沸點(diǎn)的情況下仍保持液態(tài)，保證提取過程中溶劑的充分浸潤。在封閉的系統(tǒng)中不增加壓力，溶劑水不會達(dá)到較高溫度，就不會產(chǎn)生亞臨界水，所以增大壓力是產(chǎn)生亞臨界水的必要條件[18]。通入高純氮?dú)饧訅嚎梢苑乐垢邷貤l件下紅三葉異黃酮被氧化。

由單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)結(jié)果可得，亞臨界水法提取的較優(yōu)條件為提取時(shí)間15 min、提取溫度120 ℃、液固比40 mL·g-1、提取壓力1.4 MPa，此時(shí)紅三葉總異黃酮得率為33.61 mg·g-1。本研究采用目前較常用的亞臨界水提取技術(shù)，水作為溶劑，通過溫度、壓力的持續(xù)升高使水處于亞臨界狀態(tài)[18]，水的極性和黏度都有所降低，從而增大紅三葉總異黃酮在水中的溶解度，且高純氮?dú)饧訅哼€能夠防止高溫提取過程中異黃酮被氧化[19]，提高總異黃酮提取率。婁冠群等[20]采用亞臨界水法提取香菇(Lentinusedodes)中多糖，王鳳榮等[21]采用亞臨界水法提取大豆胚芽中異黃酮，周麗等[17]采用亞臨界水法提取葛根(Poerarialobato)中異黃酮。但國內(nèi)利用亞臨界水提取法提取紅三葉總異黃酮的研究尚未見報(bào)道，本研究將亞臨界水提取技術(shù)應(yīng)用于紅三葉總異黃酮提取上是科研方面的新探究，對紅三葉總異黃酮的制備具有一定意義。

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