蔡麗艷，李志勇，孫啟忠，李鴻雁，楊玉平，劉 蕾

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010； 2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019)

我國干旱、半干旱面積占國土面積的52.5%[1]，是世界上最干旱的國家之一，特別是北方水資源相對(duì)匱乏，干旱已成為發(fā)展農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)的主要限制因素[2-3]。提高植物的抗旱能力已經(jīng)成為現(xiàn)代植物研究中急需解決的關(guān)鍵問題之一，種子萌發(fā)是植物生活史中的關(guān)鍵階段，也是進(jìn)行植物抗旱性研究的一個(gè)重要時(shí)期。由于植物抗旱性是一個(gè)受多種因素影響的數(shù)量性狀，應(yīng)采用多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)才更具有可行性和可靠性。

扁蓿豆(Medicagoruthenica)是我國北方地區(qū)不可或缺的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)飼料之一，其生態(tài)適應(yīng)性廣，生態(tài)幅較寬，生態(tài)類型多樣，在草地改良、生態(tài)治理及草產(chǎn)業(yè)開發(fā)等多種領(lǐng)域極具潛力。有研究表明，扁蓿豆葉片具有一定的旱生解剖結(jié)構(gòu)[4]，其種子萌發(fā)期的抗旱性高于黃花苜蓿(M.falcata)[5-6]，但采用多個(gè)指標(biāo)對(duì)其萌發(fā)期的抗旱性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)的研究較少。利用PEG高滲溶液模擬干旱脅迫已經(jīng)成為植物抗旱性研究的重要手段[7-9]，在玉米(Zeamays)[10]、水稻(Oryzasativa)[11]、花生(Arachishypogaea)[12]、燕麥(Avenanuda)[3]、油菜(Brassicanapus)[13]、苜蓿(M.sativa)[14]、針茅(Stipaspp.)[15]、煙草(Nicotianaspp.)[16]等植物萌發(fā)期的抗旱性研究中已使用。本試驗(yàn)采用不同濃度的PEG-6000溶液模擬脅迫，對(duì)扁蓿豆種質(zhì)資源進(jìn)行萌發(fā)期抗旱性綜合評(píng)價(jià)，以明確各供試材料對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)能力，為扁蓿豆種質(zhì)資源萌發(fā)期耐旱性鑒定提供理論依據(jù)和生產(chǎn)實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料 供試扁蓿豆材料均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所國家牧草種質(zhì)中期庫提供(表1)，種子均在2006年采收，4 ℃低溫保存。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1水分脅迫 種子發(fā)芽試驗(yàn)采用紙上培養(yǎng)法，于2012年3月15日開始在E/PGC系列進(jìn)入式植物培養(yǎng)箱(型號(hào)PGC6L)中進(jìn)行，挑選飽滿、一致的扁蓿豆種子置于鋪有兩層濾紙的、直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)。每個(gè)培養(yǎng)皿50粒種子，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。以蒸餾水為對(duì)照，在培養(yǎng)皿中分別加入5 mL由蒸餾水配置的10%、15%、20%和25%的PEG-6000溶液。根據(jù)Michel和Kaufmann[17]的公式得出對(duì)應(yīng)的滲透勢(shì)分別為-0.177、-0.393、-0.735和-1.25 MPa。

表1 試驗(yàn)材料及來源Table 1 Germplasm materials and their collection places

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG-6000對(duì)應(yīng)的滲透勢(shì)公式為：

ΨS=-(1.18×10-2)C-(1.18×10-4)C2+(2.67×10-4)CT+(8.39×10-7)C2T。

式中，ΨS為溶液的水勢(shì)(bar)，C為PEG-6000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，T為溫度(℃)。

1.2.2種子萌發(fā)試驗(yàn) 在25 ℃和相對(duì)濕度60%的恒定條件下，連續(xù)黑暗培養(yǎng)11 d。以胚根與種子等長、胚芽長度為種子長度1/2時(shí)為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，每天定時(shí)記錄種子發(fā)芽數(shù)并用電子天平稱量補(bǔ)充水分。每4 d更換一次濾紙，以盡量減少水勢(shì)變動(dòng)。發(fā)芽結(jié)束后分別測(cè)量芽長、根長和幼苗干質(zhì)量。

發(fā)芽指數(shù)=Gt/Dt。

式中，Gt為在第t天的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)。

活力指數(shù)=發(fā)芽指數(shù)×幼苗干質(zhì)量[18]。

1.2.3抗旱性綜合評(píng)價(jià)方法 用隸屬函數(shù)法對(duì)扁蓿豆材料萌發(fā)期抗旱性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。先利用公式Xu=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)計(jì)算每份材料相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)幼苗干質(zhì)量、相對(duì)發(fā)芽指數(shù)、相對(duì)活力指數(shù)的具體隸屬函數(shù)值。式中，Xu為參試植物某一抗旱指標(biāo)的測(cè)定值，Xmax和Xmin分別為所有材料中該指標(biāo)的最大值和最小值，最后把每份材料各項(xiàng)指標(biāo)隸屬函數(shù)值累加，取其平均值，根據(jù)各材料平均隸屬函數(shù)值大小確定其抗旱性強(qiáng)弱。平均值越大，抗旱性越強(qiáng)；反之，抗旱性越弱[19]。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 采用Excel 2003整理，SAS 9.0統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析法和最小顯著差異法比較不同數(shù)據(jù)組間的差異；利用NTSYSpc 2.1軟件，采用最短距離法進(jìn)行聚類分析；采用隸屬函數(shù)法對(duì)扁蓿豆種質(zhì)資源進(jìn)行萌發(fā)期抗旱性綜合評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1干旱脅迫對(duì)扁蓿豆種子發(fā)芽特性的影響 對(duì)照條件下，6份扁蓿豆材料種子的發(fā)芽率為91.33%～98.67%，且材料間沒有顯著差異(P>0.05)。隨著干旱脅迫的加劇，發(fā)芽率有所不同(圖1)，在15%PEG脅迫下02972的發(fā)芽率為64.67%，其余材料均小于50%，可以看出在輕度PEG脅迫下(濃度0～15%)，02972具有較強(qiáng)的萌發(fā)抗旱特性。PEG濃度為20%時(shí)，02972和03056的發(fā)芽率小于10%，未萌發(fā)的種子均失去了發(fā)芽能力，說明此濃度為這兩份材料的極限致死濃度，其他4份材料發(fā)芽率均大于10%且差異不顯著(P>0.05)。PEG濃度達(dá)到25%時(shí)，09288的發(fā)芽率為17.33%，顯著高于其他5份材料(P<0.05)，說明09288與其他5份材料相比，對(duì)干旱脅迫的敏感性較弱，體現(xiàn)出較強(qiáng)的萌發(fā)抗旱特性。

PEG干旱脅迫對(duì)扁蓿豆種子發(fā)芽勢(shì)的影響顯著，種子發(fā)芽勢(shì)的變化趨勢(shì)較發(fā)芽率的變化明顯(圖2)。PEG濃度為10%時(shí)，所有供試材料的發(fā)芽勢(shì)均低于51%，03056和02972顯著高于其他4種材料(P<0.05)；當(dāng)PEG濃度達(dá)到20%時(shí)，發(fā)芽勢(shì)均接近0，即發(fā)芽前5 d所有材料的種子幾乎均未發(fā)芽，說明隨著PEG脅迫加劇種子的發(fā)芽整齊度明顯降低。

圖1 扁蓿豆種質(zhì)材料在不同PEG-6000濃度下的發(fā)芽率Fig.1 Seed germination rates of Medicago ruthenica under different PEG-6000 stress

圖2 扁蓿豆種質(zhì)材料在不同PEG-6000濃度下的發(fā)芽勢(shì)Fig.2 Seed germination potential of Medicago ruthenica under different PEG-6000 stress

隨著PEG濃度加大，6份扁蓿豆材料種子的發(fā)芽指數(shù)急劇下降，當(dāng)濃度為10%時(shí)，發(fā)芽率為60.61%～86.00%，但發(fā)芽指數(shù)均不足對(duì)照的1/2(圖3)，表明該濃度下雖然種子具有較高的發(fā)芽能力，但其已經(jīng)發(fā)生劣變，種子活力已經(jīng)顯著下降。

PEG濃度為0～15%時(shí)，03056的種子活力指數(shù)與其他材料相比，處于較高水平，顯著高于02988和02956(P<0.05)(圖4)；隨著PEG濃度的進(jìn)一步加大，來源于荒漠草原的02982和02988表現(xiàn)出較好的抗旱性。

圖3 扁蓿豆種質(zhì)材料在不同PEG-6000濃度下的發(fā)芽指數(shù)Fig.3 Seed germination index of Medicago ruthenica under different PEG-6000 stress

圖4 扁蓿豆種質(zhì)材料在不同PEG-6000濃度下的活力指數(shù)Fig.4 Seed vigor index of Medicago ruthenica under different PEG-6000 stress

2.2干旱脅迫對(duì)扁蓿豆幼苗生長的影響 幼苗的芽長和根系生長對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)相似，6份扁蓿豆種質(zhì)材料種子的芽長和根長均隨干旱脅迫的加劇而下降，但變化幅度有所不同。方差分析表明(表2)，芽長在所有處理中均表現(xiàn)出顯著(P<0.05)或極顯著差異(P<0.01)。隨著PEG濃度加大，扁蓿豆的芽長急劇下降，各材料間的差異也逐漸加大。在PEG濃度為15%時(shí)，根長與其他處理間呈極顯著差異(P<0.01)，此時(shí)根系的生長被顯著抑制，且材料間的差異也加大(變異系數(shù)為0.394 9)，說明該濃度可作為扁蓿豆種子萌發(fā)期抗旱性鑒定的最佳濃度。

隨著PEG濃度增加，幼苗的芽長和根長都在減小，但根長/芽長的值逐漸增加，PEG濃度為20%和25%時(shí)，近一半幼苗的胚芽不再生長，因此沒有測(cè)出根長/芽長的值。這表明與根長相比，芽長受到干旱脅迫時(shí)的響應(yīng)更為明顯。PEG濃度為15%時(shí)，根長/芽長的均值為2.568 2，不同材料間呈極顯著差異(P<0.01)，此時(shí)的變異系數(shù)為0.450 8，較對(duì)照和10% PEG下都高。因此，就芽長/根長這一性狀來說，15% PEG濃度可作為扁蓿豆萌發(fā)期抗旱性鑒定的最佳濃度。6份扁蓿豆材料幼苗的干質(zhì)量均隨著PEG濃度加大而降低，但不同處理下各材料間差異未達(dá)到顯著水平(P>0.05)，在PEG濃度為0、10%和15%時(shí)，03056的干質(zhì)量均較大；就幼苗干質(zhì)量的整體下降速度而言，03056下降較快，而02988在6份材料中最為緩慢，所以02988萌發(fā)期的抗旱性強(qiáng)于其他材料。

表2 扁蓿豆種質(zhì)材料在不同PEG-6000濃度下芽長、根長和幼苗干質(zhì)量的差異Table 2 The bud and root length, and dry weight of Medicago ruthenica seedlings under different PEG-6000 stress

2.3扁蓿豆種質(zhì)材料的抗旱性綜合評(píng)價(jià) 用模糊函數(shù)隸屬法對(duì)6份扁蓿豆種質(zhì)材料相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)幼苗干質(zhì)量、相對(duì)發(fā)芽指數(shù)和相對(duì)活力指數(shù)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，得到6份扁蓿豆材料的隸屬函數(shù)總平均值，并根據(jù)均值的大小進(jìn)行排序(表3)。得出6份扁蓿豆材料抗旱性隸屬函數(shù)總平均值范圍為0.444 4～0.521 7，其中02972、03056和02988種子萌發(fā)期的抗旱性較強(qiáng)，而02982的抗旱性最弱。

結(jié)合以上各測(cè)定指標(biāo)，采用最短距離法，將供試的6份扁蓿豆材料進(jìn)行聚類分析(圖5)，當(dāng)閾值為0.024時(shí)，可以把6份材料分為4類。其中來源于典型草原的02920、02956和來源于荒漠草原02982聚為一類，通過抗旱性綜合分析發(fā)現(xiàn)，這3份種質(zhì)的萌發(fā)抗旱性均較弱；來源于荒漠草原的02988、03056和來源于典型草原的02972各自為一類，其中02972與其他5份材料的遺傳距離較大。

表3 耐旱指標(biāo)隸屬值及耐旱性綜合評(píng)價(jià)Table 3 Subordinate function values of drought resistances and comprehensive evaluation of six germplasm materials of Medicago ruthenica

3 討論與結(jié)論

牧草種子萌發(fā)和幼苗階段的抗逆性強(qiáng)弱是影響草地建植成敗的關(guān)鍵[20]。在種子萌發(fā)和幼苗生長階段，對(duì)土壤水分和溫度的變化較敏感，隨著牧草生長，其抗旱能力逐漸增強(qiáng)。因此,研究扁蓿豆材料在這兩個(gè)時(shí)期的抗旱性對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐具有重要的指導(dǎo)意義。利用PEG-6000模擬干旱水分脅迫，以評(píng)價(jià)和鑒定不同材料種子發(fā)芽階段的耐旱性是一種比較可靠的方法[21-23]。種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)作為植物種子在水分脅迫下的耐旱指標(biāo)，能反映植物種子發(fā)芽速度、發(fā)芽整齊度和幼苗健壯的趨勢(shì)，因此，常用于了解不同材料在水分脅迫下的抗旱性程度。本研究利用PEG-6000模擬干旱脅迫對(duì)6份扁蓿豆種質(zhì)材料種子萌發(fā)的差異性來反映它們的抗旱能力的大小。6份扁蓿豆材料的種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、芽長、根長及幼苗干質(zhì)量基本上都隨脅迫程度的加劇呈下降趨勢(shì)。根長與芽長的比值則隨著PEG干旱脅迫的加劇而增大，當(dāng)PEG濃度達(dá)到20%時(shí)，只有胚根生長，而胚芽不再生長，這可能是由于水分脅迫下，植物吸收的營養(yǎng)物質(zhì)優(yōu)先供給地下器官(胚根)，促進(jìn)幼苗成活和生長，以適應(yīng)外界不良環(huán)境[24]。

以不同指標(biāo)為依據(jù)，測(cè)定各材料的抗旱性順序并不完全一致，不同材料對(duì)某個(gè)指標(biāo)的耐旱性不盡相同，單一指標(biāo)難以綜合反映供試材料的抗旱性強(qiáng)弱[25-26]。因此，本研究利用聚類分析法和模糊數(shù)學(xué)中的隸屬函數(shù)法對(duì)發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、幼苗干質(zhì)量、發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)等多指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)以避免單因素評(píng)定的差異，力爭全面反映扁蓿豆種質(zhì)資源的抗旱性。結(jié)果顯示，6份扁蓿豆種質(zhì)資源中，來源于通遼市大青溝自然保護(hù)區(qū)的02972號(hào)材料在種子萌發(fā)期的抗旱性最強(qiáng)，來源于包頭市土默特右旗的03056和02988號(hào)材料的抗旱性較強(qiáng)，這3份種質(zhì)在幼苗及成株階段的抗旱性如何，我們將繼續(xù)觀測(cè)，為選育優(yōu)異的扁蓿豆抗旱材料奠定基礎(chǔ)；來自錫林郭勒盟的02920和02956及呼和浩特市武川縣的02982抗旱性較弱。

[1] 張智猛,戴良香,丁紅,等.中國北方主栽花生品種抗旱性鑒定與評(píng)價(jià)[J].作物學(xué)報(bào),2012,38(3):495-504.

[2] 山侖,徐炳成.黃土高原半干旱區(qū)建設(shè)穩(wěn)定人工草地的探討[J].草業(yè)學(xué)報(bào),2009,18(2):1-2.

[3] 牛瑞明,王燕,吳桂麗,等.裸燕麥種子萌發(fā)對(duì)模擬干旱脅迫的響應(yīng)及其耐旱性綜合評(píng)價(jià)[J].麥類作物學(xué)報(bào),2011,31(4):753-756.

[4] 石鳳翎,郭曉霞,李紅.扁蓿豆抗旱形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)觀察與分析[J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究,2005,23(2):115-118.

[5] 趙麗麗,王照蘭,杜建材,等.扁蓿豆不同種質(zhì)材料種子萌發(fā)期抗旱性比較[J].種子,2007,26(12):13-16.

[6] 胡卉芳,王照蘭,杜建材,等.PEG脅迫下不同品系扁蓿豆種子的萌發(fā)特性[J].草原與草坪,2010(3):74-77.

[7] 朱教君,李智輝,康宏樟,等.聚乙二醇模擬水分脅迫對(duì)沙地樟子松種子萌發(fā)影響研究[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),2005,16(5):801-804.

[8] 張晨妮,周青平,顏紅波,等.PEG-6000對(duì)老芒麥種質(zhì)材料萌發(fā)期抗旱性影響的研究[J].草業(yè)科學(xué),2010,27(1):119-123.

[9] 秦文靜,梁宗鎖.四種豆科牧草萌發(fā)期對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)及抗旱性評(píng)價(jià)[J].草業(yè)學(xué)報(bào),2010,19(4):61-70.

[10] 董志強(qiáng),賈秀領(lǐng),張麗華,等.玉米種子萌發(fā)期抗旱性鑒定方法及不同雜交種抗旱性比較研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2012,27(1):178-183.

[11] 安永平,強(qiáng)愛玲,張媛媛,等.滲透脅迫下水稻種子萌發(fā)特性及抗旱性鑒定指標(biāo)研究[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào),2006,7(4):421-426.

[12] 孫奎香,于遒功,張玉鳳,等.水分脅迫對(duì)花生種子萌發(fā)過程中貯藏物質(zhì)降解的影響[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2012,28(12):60-65.

[13] 張霞，謝小玉.PEG脅迫下甘藍(lán)型油菜種子萌發(fā)期抗旱鑒定指標(biāo)的研究[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2012,21(2):72-77.

[14] 馬巧利,孫彥,楊青川,等.NaCl和等滲PEG4000脅迫對(duì)紫花苜蓿種子發(fā)芽及生理活性的影響[J].草地學(xué)報(bào),2012,20(3):547-552.

[15] 于魯寧，程積民，李媛，等.干旱脅迫對(duì)3種針茅種子萌發(fā)期抗旱性影響的研究[J].水土保持通報(bào),2012,32(3):33-36,41.

[16] 馬文廣,崔華威,李永平,等.20個(gè)煙草品種干旱脅迫下發(fā)芽和苗期生理特性及耐旱性評(píng)價(jià)[J].種子,2012,31(2):25-30.

[17] Michel B E,Kaufmann M R.The osmotic potential of polyethylene glycol 6000[J].Plant Physiology,1973,51:914-916.

[18] 王東娟,石鳳翎,李志勇,等.雀麥屬3種多年生牧草在PEG脅迫下種子活力與抗旱性研究[J].種子,2009,28(5):31-34.

[19] 孫群,胡景江.植物生理學(xué)研究技術(shù)[M].楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué)出版社,2005:67.

[20] 曾彥軍,王彥榮.幾種旱生灌木種子萌發(fā)對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2002,13(8):953-956.

[21] 王瑞峰,王鐵梅,金曉明,等.1個(gè)審定苜蓿品種種子萌發(fā)期耐鹽性評(píng)價(jià)[J].草業(yè)科學(xué),2012,29(2):213-218.

[22] 余玲,王彥榮,孫建華.環(huán)境脅迫對(duì)布頓大麥種子萌發(fā)及種苗生長發(fā)育的影響[J].草業(yè)學(xué)報(bào),2002,11(2):79-84.

[23] 楊鑫光,傅華,牛得草.干旱脅迫下幼苗期霸王的生理響應(yīng)[J].草業(yè)學(xué)報(bào),2007,16(5):107-112.

[24] 胡曉艷,呼天明,李紅星.草坪草馬蹄金與結(jié)縷草種子萌發(fā)期抗旱性比較[J].草業(yè)科學(xué),2006,23(1):89-92.

[25] 揭雨成,黃丕生,李宗道.竺麻基因型抗旱性差異及其早期鑒定研究[J].作物學(xué)報(bào),2000,26(6):942-946.

[26] 彭明俊,趙琳,溫紹龍,等.4種禾本科牧草種子的抗旱性評(píng)價(jià)[J].西部林業(yè)科學(xué),2006,35(2):74-77.