吳建慧，崔艷桃，趙倩竹

(東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

委陵菜屬(Potentilla)植物是薔薇科一年生或多年生植物，花色艷麗、枝條鞣韌、株型美觀，具有一定的觀賞價(jià)值，并且具有較強(qiáng)的抗旱、抗寒性，容易栽培和管理，生態(tài)適應(yīng)性較強(qiáng)，是退化草地或次生演替地的先鋒物種之一[1]。近年來，委陵菜屬植物因其具有自然性、原生性、抗逆性強(qiáng)、可粗放管理等特點(diǎn)[2]，在城市的環(huán)境綠化和美化中開始廣泛應(yīng)用。

水分是影響植物生長、發(fā)育和分布的主要環(huán)境因子之一，所以干旱對植物的危害程度在諸多非生物脅迫中占首位。植物的耐旱性是指植物通過一定的抗旱方式在長期干旱脅迫下的生存能力[3]，對干旱脅迫條件下植物的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理特性以及遺傳規(guī)律的研究表明，干旱脅迫會降低植物的光合作用、破壞呼吸鏈、降低碳代謝途徑中一些酶的活性，也會改變植物組織器官的超微結(jié)構(gòu)[4]。目前，對委陵菜屬植物的研究主要集中在園林應(yīng)用價(jià)值[5]、引種馴化[6]、花粉形態(tài)[7]以及藥用價(jià)值[8]等方面，耐旱性[9]的研究相對較少，多見于絹毛委陵菜(P.sericea)、鵝絨委陵菜(P.anserina)等。本研究以委陵菜(P.chinensis)、翻白委陵菜(P.discolor)、白葉委陵菜(P.leucophylla)、輪葉委陵菜(P.verticillaris)為試驗(yàn)材料，在干旱脅迫條件下，比較葉肉細(xì)胞中葉綠體、線粒體等超微結(jié)構(gòu)的變化，以期從細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)方面來了解其耐旱機(jī)制并比較不同委陵菜屬植物的耐旱能力，為耐旱品種的篩選與培育提供理論依據(jù)，也為干旱地區(qū)綠化建設(shè)的植物選材提供依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)材料為4種野生委陵菜屬植物，分別是委陵菜、翻白委陵菜、白葉委陵菜、輪葉委陵菜。2010年8月在大慶草原采集野生種子，2011年3月播種，將幼苗移栽至直徑為9 cm的小盆里，統(tǒng)一管理。

2011年7月選取生長一致、發(fā)育正常的植株，提供充足的陽光、水分和營養(yǎng)，保證其正常生長。開始脅迫試驗(yàn)后停止供水，使其自然失水，以土壤含水量作為干旱脅迫梯度的標(biāo)準(zhǔn)，土壤含水量為35%～40%是正常狀態(tài)、25%～30%是輕度干旱脅迫、15%～20%是中度干旱脅迫、5%～10%是重度干旱脅迫，用稱重法補(bǔ)充水分以維持土壤含水量，直至脅迫結(jié)束，每組處理重復(fù)3次。

樣品的制備：在葉片中脈附近切取1 mm×1 mm的材料，用3%戊二醛固定24 h以上，磷酸緩沖液(pH值為7.2)漂洗3次，每次約20 min，然后在4 ℃條件下用1%鋨酸固定4 h，用去離子水漂洗3次，每次20 min，再用乙醇系列進(jìn)行脫水，丙酮過渡，隨后用環(huán)氧樹脂812滲透包埋，LKB5切片機(jī)切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染，用H7650透射電鏡進(jìn)行觀察，隨機(jī)選擇含有葉肉細(xì)胞的不同視野照相。

每個(gè)處理隨機(jī)選取10個(gè)視野，測量葉綠體大小(以面積表示)，取平均值，重復(fù)3次；每個(gè)處理隨機(jī)觀察10個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)葉綠體的數(shù)量，取平均值，重復(fù)3次。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1干旱脅迫對葉肉細(xì)胞的影響 在自然狀態(tài)下，4種委陵菜屬植物的葉肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本相同(圖1-A,圖1-E,圖1-I,圖1-M)；在輕度脅迫狀態(tài)下，4種委陵菜屬植物的葉肉細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生輕微變化(圖1-B,圖1-F,圖1-J,圖1-N)；在中度脅迫狀態(tài)下，委陵菜和翻白委陵菜質(zhì)壁分離明顯，局部細(xì)胞膜破裂，葉綠體內(nèi)部結(jié)構(gòu)混亂(圖1-C,圖1-G)，白葉委陵菜和輪葉委陵菜的結(jié)構(gòu)基本完整(圖1-K，圖1-O)；在重度脅迫狀態(tài)下，委陵菜的細(xì)胞膜破裂，內(nèi)含物外流，葉綠體解體(圖1-D)，翻白委陵菜的葉綠體有團(tuán)聚現(xiàn)象出現(xiàn)(圖1-H)，白葉委陵菜和輪葉委陵菜的細(xì)胞膜基本完整，葉綠體結(jié)構(gòu)散亂，白葉委陵菜葉綠體被膜破裂，有內(nèi)含物外流(圖1-L，圖1-P)。

隨著干旱脅迫程度的加強(qiáng)，葉肉細(xì)胞的受損程度逐漸加強(qiáng)，葉綠體發(fā)生了明顯的變化，受損越來越嚴(yán)重，而且不同的植物在相同的脅迫條件下葉肉細(xì)胞的受損程度也不同。在相同的干旱條件下，委陵菜的葉肉細(xì)胞受損最重，輪葉委陵菜的葉肉細(xì)胞受損最輕(圖1)。

圖1 干旱脅迫對4種委陵菜葉肉細(xì)胞的影響Fig.1 Drought stress on the cell of four Potentilla species

2.2干旱脅迫對葉肉細(xì)胞葉綠體結(jié)構(gòu)的影響 自然狀態(tài)下4種委陵菜屬植物的葉肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本相同，沒有明顯差異。細(xì)胞質(zhì)壁結(jié)合緊密，葉綠體數(shù)量多，基粒片層和基質(zhì)類囊體膜結(jié)構(gòu)清晰、排列整齊，具有少量的嗜鋨顆粒(圖2-A,圖2-E,圖2-I,圖2-M)。

在輕度脅迫時(shí)，細(xì)胞壁稍變厚，葉綠體體積增大，外被膜仍然清晰且基本完整。委陵菜的葉綠體不貼壁分布，葉綠體類囊體片層膨脹明顯，嗜鋨顆粒明顯增多(圖2-B)；翻白委陵菜、白葉委陵菜和輪葉委陵菜的葉綠體及其他細(xì)胞器局部貼壁分布，葉綠體基粒片層輕微扭曲，嗜鋨顆粒數(shù)量變化不明顯(圖2-F,圖2-J,圖2-N)。

在中度脅迫時(shí)，細(xì)胞壁厚度增加，細(xì)胞質(zhì)壁分離明顯，葉綠體拉長或變成近球狀，嗜鋨顆粒數(shù)量增多，且有大的嗜鋨顆粒出現(xiàn)。委陵菜的葉綠體外被膜局部破裂，基粒和基質(zhì)類囊體膜結(jié)構(gòu)模糊，呈波浪狀，基粒出現(xiàn)膨脹且排列混亂(圖2-C)；翻白委陵菜的葉綠體類囊體片層擴(kuò)張，外膜消失，基粒片層膨脹、溶解或空泡化、破裂，基粒垛疊程度下降(圖2-G)；白葉委陵菜的葉綠體被膜仍然清晰但不完整，局部出現(xiàn)斷裂，基粒和基質(zhì)類囊體膜結(jié)構(gòu)模糊，但仍排列有序(圖2-K)；輪葉委陵菜的葉綠體受損相對較輕，結(jié)構(gòu)基本完整(圖2-O)。

圖2 干旱脅迫對4種委陵菜葉肉細(xì)胞葉綠體結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 Drought stress on the chloroplast of four Potentilla species

在重度脅迫時(shí)，委陵菜的葉綠體被膜破裂，甚至完全解體，內(nèi)含物外流，片層結(jié)構(gòu)排列紊亂(圖2-D)；翻白委陵菜的葉綠體出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象(圖2-H)；白葉委陵菜的葉綠體被膜破裂，有內(nèi)含物外流(圖2-L)；輪葉委陵菜的葉綠體基粒和基質(zhì)類囊體膜結(jié)構(gòu)呈波浪狀，有較寬的間距出現(xiàn)，基粒出現(xiàn)彎曲以及膨脹(圖2-P)。

在相同的干旱脅迫條件下，委陵菜的葉綠體破損最嚴(yán)重，輪葉委陵菜葉綠體的破損程度相對較輕。

2.3干旱脅迫對4種委陵菜屬植物葉綠體大小和數(shù)量的影響 隨著干旱脅迫程度的加強(qiáng)，4種植物的葉綠體大小呈逐漸減小的趨勢，葉綠體數(shù)量呈逐漸增多的趨勢(表1，圖1)。委陵菜、翻白委陵菜、白葉委陵菜、輪葉委陵菜葉綠體變化率分別為77.19%、71.22%、70.52%、62.01%。

2.4干旱脅迫對葉肉細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)的影響 正常條件下委陵菜屬植物葉片細(xì)胞中線粒體多呈較規(guī)則的橢圓形或長橢圓形，雙層被膜結(jié)構(gòu)完整，脊較豐富，內(nèi)嵴小而少，細(xì)胞質(zhì)濃(圖3-A,圖3-E,圖3-I,圖3-M)。

表1 干旱脅迫對4種委陵菜葉綠體大小和數(shù)量的影響Table 1 Effects of drought stress on chloroplast size and number of four Potentilla species

輕度脅迫條件下，線粒體數(shù)量增多，線粒體膨脹，拉長或變圓，委陵菜的部分線粒體內(nèi)外膜和嵴變模糊，嵴數(shù)量變少(圖3-B)；翻白委陵菜的線粒體結(jié)構(gòu)保持完整，但脊的數(shù)目增加，并略微腫脹(圖3-F)；白葉委陵菜的線粒體外膜受到破壞，內(nèi)部無明顯變化(圖3-J)；輪葉委陵菜的線粒體結(jié)構(gòu)保持完整，沒有明顯變化(圖3-N)。

中度脅迫條件下，委陵菜的線粒體外膜出現(xiàn)降解現(xiàn)象，內(nèi)部脊變少(圖3-C)；翻白委陵菜的線粒體局部外膜破裂(圖3-G)；白葉委陵菜的部分線粒體內(nèi)外膜和嵴變模糊，嵴數(shù)量變少，細(xì)胞質(zhì)變淺(圖3-K)；輪葉委陵菜的線粒體外膜清楚，但內(nèi)部結(jié)構(gòu)模糊不清(圖3-O)。

重度脅迫條件下，委陵菜的線粒體開始降解，內(nèi)含物流出(圖3-D)；翻白委陵菜的線粒體內(nèi)外膜破裂，嵴消失，線粒體出現(xiàn)空泡化(圖3-H)；白葉委陵菜的線粒體內(nèi)外膜膨大或破裂，內(nèi)含物流出(圖3-L)；輪葉委陵菜線粒體外膜清楚，但內(nèi)部結(jié)構(gòu)模糊不清(圖3-P)。

圖3 干旱脅迫對輪葉委陵菜葉肉細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)的影響Fig.3 Drought stress on the mitochondria of four Potentilla species

在相同的干旱脅迫條件下，委陵菜的線粒體被破壞得最嚴(yán)重，輪葉委陵菜的線粒體損壞程度相對最輕。

3 討論

植物暴露在自然環(huán)境中最多的是葉片，葉片對外界環(huán)境的變化很敏感，也比較容易適應(yīng)環(huán)境，因而形態(tài)和結(jié)構(gòu)易隨環(huán)境改變[10-12]。葉肉細(xì)胞中葉綠體和線粒體是植物光合作用、能量流動的細(xì)胞器，也是對環(huán)境反應(yīng)很敏感的細(xì)胞器[13]。因此，在干旱脅迫條件下，比較觀察4種委陵菜屬植物的葉綠體、線粒體等細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，是判斷其耐旱能力的方法之一。

在葉肉細(xì)胞中，葉綠體和線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)、大小、數(shù)目和分布常因植物所處的環(huán)境條件不同而發(fā)生相應(yīng)變化[14]，尤其在逆境脅迫下其結(jié)構(gòu)和生理功能的變化更為顯著[15]。本試驗(yàn)中，在輕度脅迫下，4種植物葉肉細(xì)胞均輕微受損，區(qū)別不太明顯；在中度脅迫下，委陵菜和翻白委陵菜的葉肉細(xì)胞受損程度相對較重，白葉委陵菜和輪葉委陵菜的受損程度相對較輕；在重度脅迫時(shí)，委陵菜的葉肉細(xì)胞被破壞的最嚴(yán)重，輪葉委陵菜的受損程度最輕。說明隨著干旱脅迫程度的加強(qiáng)，4種植物葉肉細(xì)胞的受損程度均逐漸加強(qiáng)，而且不同的植物在相同的脅迫條件下葉肉細(xì)胞的受損程度不同。

葉綠體是植物光合作用的場所，對水分的虧缺較敏感，它的正常與否是判斷植物細(xì)胞活性的一個(gè)重要指標(biāo)[16]。本試驗(yàn)中，在輕度脅迫時(shí)，委陵菜葉綠體受損相對嚴(yán)重，翻白委陵菜、白葉委陵菜和輪葉委陵菜的葉綠體受損相對較輕；在中度脅迫時(shí)，白葉委陵菜和輪葉委陵菜的葉綠體受損較輕，翻白委陵菜和委陵菜的葉綠體受損相對較重；在重度脅迫時(shí)，葉綠體受損程度為輪葉委陵菜<白葉委陵菜<翻白委陵菜<委陵菜，而且委陵菜、翻白委陵菜、白葉委陵菜和輪葉委陵菜4種植物的葉綠體的變化率分別為77.19%、71.22%、70.52%和62.01%，呈逐漸減小的趨勢，說明隨著干旱脅迫程度的增加，葉綠體的受損越嚴(yán)重，且不同植物的葉綠體對干旱脅迫的反應(yīng)不同，因此在干旱脅迫中葉綠體的受損程度可以作為判斷植物耐旱性強(qiáng)弱的依據(jù)之一。陳建輝等[17]研究表明，葉綠體結(jié)構(gòu)的變化可以作為評價(jià)大麥(Hordeumsativum)耐旱性強(qiáng)弱的形態(tài)結(jié)構(gòu)指標(biāo)。郁慧等[18]研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下不同植物的葉綠體結(jié)構(gòu)的受損程度與其抗旱性強(qiáng)弱相對應(yīng)。鄭敏娜等[19]研究指出，水分脅迫下6種牧草葉肉細(xì)胞葉綠體結(jié)構(gòu)的受損程度與各牧草抗旱性強(qiáng)弱相對應(yīng)。本研究中，干旱脅迫條件下，耐旱性強(qiáng)的葉綠體受損較輕，耐旱性弱的葉綠體受損較重，此結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致。

線粒體是動力工廠，是進(jìn)行呼吸作用的主要場所，為植物的生命活動提供能量。細(xì)胞中線粒體的數(shù)目，以及線粒體中嵴的多少，與細(xì)胞的生理狀態(tài)有關(guān)。當(dāng)代謝旺盛、能量消耗多時(shí)，細(xì)胞就具有較多的線粒體，其內(nèi)有較密的嵴；反之，代謝較弱的細(xì)胞，線粒體較少，內(nèi)部嵴也較疏。當(dāng)植物受到干旱脅迫時(shí)，線粒體膜的破壞、嵴的減少甚至消失必將影響到葉綠素合成、貯藏及光合作用的主要器官。本試驗(yàn)中，在輕度脅迫時(shí)，委陵菜的線粒體受損相對嚴(yán)重，其他3種植物的線粒體損壞不明顯；在中度脅迫時(shí)，白葉委陵菜和輪葉委陵菜的線粒體受損較輕，委陵菜最嚴(yán)重；在重度脅迫時(shí)，委陵菜的線粒體被破壞得最嚴(yán)重，輪葉委陵菜的線粒體損壞程度相對最輕。說明隨著干旱脅迫程度的增加，線粒體的受損越嚴(yán)重，且不同植物的線粒體對干旱脅迫的反應(yīng)不同，但是線粒體結(jié)構(gòu)的變化與葉綠體相比，表現(xiàn)較為遲鈍。陳燕等[20]研究表明，線粒體結(jié)構(gòu)的變化比葉綠體略遲鈍，但隨著葉綠體的傷害加重，線粒體脊也迅速斷裂、解體并空泡化而喪失功能。黑麥草(Loliumperenne)[21]和絹毛委陵菜[22]線粒體對干旱脅迫的耐受力要比葉綠體的強(qiáng)，且不同植物的線粒體結(jié)構(gòu)受損程度與其抗旱性強(qiáng)弱相對應(yīng)。本研究中，干旱脅迫條件下，耐旱性強(qiáng)的委陵菜屬植物的線粒體受損害較輕，耐旱性弱的線粒體受損害較重，此結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致。

綜上所述，通過對4種委陵菜屬植物葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，在同一干旱脅迫條件下，不同植物的葉肉細(xì)胞受損程度不同，而且隨著干旱脅迫的加強(qiáng)，植物葉肉細(xì)胞受損越嚴(yán)重。依據(jù)植物在干旱脅迫時(shí)發(fā)生的變化和試驗(yàn)結(jié)果的分析表明，4種委陵菜屬植物耐旱能力的大小依次為：輪葉委陵菜>白葉委陵菜>翻白委陵菜>委陵菜。

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