成凱凱，魏小蘭，杜 鵑，張?zhí)N薇

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)草地研究所，北京100193）

野牛草（Buchloedactyloides）為多年生暖季型C4草本植物，是生長在北美草原上最古老的禾本科植物之一，起源于美洲中南部［1］，自然群落主要分布在美國、加拿大、墨西哥中部的干旱地帶［2］，常與格蘭馬草（Boutelouagracilis）等一起構(gòu)成草原景觀［3］。因其具有很多優(yōu)良特性及較好的坪用性狀（如耐旱、植株低矮、葉片纖細柔軟等）而逐漸被用于草坪種植，又因具有優(yōu)越的抗病蟲能力、抗旱性及適應(yīng)性，日益成為我國華北、東北、西北等地區(qū)園林綠化、環(huán)境保護、水土保持的主要草種之一。

簡單重復(fù)序列區(qū)間擴增（Inter-Simple Sequence Repeat，ISSR）是近年來一種以微衛(wèi)星為引物的新型PCR分子標記技術(shù)［4］。目前常用的ISSR引物是由加拿大哥倫比亞大學(xué)（University of British Columbia，UBC）設(shè)計的96個ISSR 引物［5］。近年來ISSR技術(shù)已在品種鑒定［6-7］、遺傳作圖［8-9］和居群遺傳學(xué)［10］等研究領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用。

本研究通過對30份不同地理來源的野牛草種質(zhì)資源坪用性狀的測定以及ISSR分子標記，分析供試材料的遺傳多樣性，檢測材料的遺傳結(jié)構(gòu)及親緣關(guān)系，通過聚類分析初步將種質(zhì)歸類，選擇性狀優(yōu)良且親緣關(guān)系較遠的種質(zhì)作為將來育種的材料，同時為野牛草種質(zhì)資源的保護及利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料 本試驗的30份野牛草種質(zhì)搜集于美國和中國，地理來源不同，2007年移栽至中國農(nóng)業(yè)大學(xué)上莊試驗站。地理位置115°50′E，40°02′N，海拔50m。暖溫帶大陸性季風(fēng)氣候，年平均氣溫11.4℃，絕對最低溫-21.7℃，絕對最高溫為41.6℃，年平均降水量628mm。全年無霜期211d。由于特殊原因，具體地理來源已不明。

1.2 田間觀測 于2010年7月-2011年7月進行田間觀測。從開花期開始測定的形態(tài)學(xué)指標有葉長、葉寬、株高、莖粗、匍匐莖長度、匍匐莖數(shù)目和匍匐莖節(jié)數(shù)；成熟期測定的生理指標包括葉色和葉片枯黃程度。其中選中的葉片在單株中用線和標牌分別進行標記，以便進行連續(xù)觀測。

葉長：開花期，隨機選取任意分蘗枝下端第2片葉片用直尺測定其長度，重復(fù)3次。

葉寬：開花期，用游標卡尺測定以上選取的葉片中部的寬度，重復(fù)3次。

株高：用直尺測定野牛草的絕對高度，從開花期開始連續(xù)測定3次，每次間隔10d。

莖粗：開花期，隨機選取任意分蘗枝，用游標卡尺測定其莖基部的直徑，同一植株3個重復(fù)。

分蘗數(shù)：在分蘗期、開花期和結(jié)實期各測定1次。

匍匐莖長度：用直尺測定，從開花期開始連續(xù)測定3次，每次間隔10d。

匍匐莖節(jié)數(shù)：統(tǒng)計測定的最長匍匐莖的節(jié)數(shù)，從開花期開始連續(xù)統(tǒng)計3次，每次間隔10d。

匍匐莖數(shù)目：從開花期開始連續(xù)測定3次，每次間隔10d。

葉色：在野牛草成熟期（7和8月），每株隨機選取任3個葉片采用葉綠素測定儀（SPAD儀）測定SPAD值，并對選定葉片做記號，重復(fù)3次。

葉片枯黃程度：2010年10月4日、10月14日和10月24日每個單株標記3個葉片，分別測定葉片總長度和枯黃部分的長度，以枯黃部分占葉片總長度的比值表示葉片枯黃程度。

1.3 野牛草基因組DNA的提取 選取野牛草健康幼葉，用CTAB法［11］提取其基因組DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測其濃度和純度，合格的DNA樣品于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 ISSR-PCR體系的建立及優(yōu)化 根據(jù)之前發(fā)表的ISSR-PCR反應(yīng)體系［12-17］，經(jīng)優(yōu)化后得到下述體系：總體積25μL，其中1×buffer 1.5μL、dNTP 0.3mmol·L-1、Taq酶1.0U、Primers 0.6 μmol·L-1、Mg2＋1.0mmol·L-1、DNA 模板50 ng，雙蒸水補足25μL。

1.5 引物篩選和PCR反應(yīng) 本試驗中ISSR反應(yīng)采用的引物序列均由加拿大哥倫比亞大學(xué)提供，由上海生物工程公司合成，共33條［18］。

PCR擴增程序：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，48～60℃退火30s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min，4℃保存［12］。

1.6 電泳檢測 本試驗采用的是12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，以盛旭百川生物科技公司生產(chǎn)的DL2000為Marker，110V電壓下電泳4h，停止電泳后在0.1%硝酸銀溶液中銀染，NaOH溶液中顯影，然后拍照，供數(shù)據(jù)分析。

1.7 數(shù)據(jù)分析 田間試驗數(shù)據(jù)采用SAS 8.2進行差異顯著性分析和聚類分析。

分子試驗數(shù)據(jù)分析方面，對獲得的清晰可重復(fù)的DNA條帶進行統(tǒng)計，在相同遷移位置上，根據(jù)條帶的有無記為1或0，構(gòu)成原始數(shù)據(jù)矩陣。

根據(jù)原始矩陣，統(tǒng)計得到的總條帶數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)，通過計算多態(tài)性位點百分率（Percentage of Polymorphic Bands，PPB），引物多態(tài)性含量（Polymorphism Information Content，PIC）和遺傳相似系數(shù)（GS）來估計遺傳多樣性。

式中，TNB指ISSR擴增的總條帶數(shù)（Total Number of Bands），NPB指多態(tài)性條帶數(shù)（Number of Polymorphic Bands）；PIC＝1-∑Pi2，Pi為i位點的基因頻率。

式中，Nij為材料i和j共有的擴增條帶數(shù)，Ni為材料i的擴增條帶數(shù)，Nj為材料j的擴增條帶數(shù)；遺傳距離GD＝1-GS。利用NTSYS-PC 2.10軟件計算Dice遺傳相似系數(shù)，根據(jù)GS值按不加權(quán)成對群算術(shù)平均法（UPGMA）對野牛草種質(zhì)材料進行遺傳相似性聚類和主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地理來源野牛草的坪用性狀觀測30份不同地理來源的野牛草單株相互之間在基本坪用性狀上存在很大差異。葉長、葉寬、株高、匍匐莖長度和匍匐莖節(jié)數(shù)差異極顯著（P＜0.01）；莖粗、葉色呈顯著差異（P＜0.05）；分蘗數(shù)、匍匐莖數(shù)目和葉片枯黃程度無顯著差異（P＞0.05）（表1）。

根據(jù)形態(tài)學(xué)指標可將30份不同地理來源野牛草分為4類，第Ⅰ類材料有16份，包括2、3、4、5、7、8、12、14、16、17、19、21、22、25、28、29；第 Ⅱ 類 材料7份，包括9、10、11、23、24、26、27；第Ⅲ類材料3份，包括1、6、30；第Ⅳ類材料4份，包括13、15、18、20（圖1）。

表1 不同地理來源野牛草坪用性狀觀測Table 1 Observation of turf characteristics of 30different geographical origin Buchloe dactyloides

2.2 供試材料ISSR擴增產(chǎn)物的多態(tài)性分析從33條引物中選擇了7條［18］擴增條帶多態(tài)性好、清晰穩(wěn)定的引物對30份材料進行PCR擴增，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）的檢測，部分結(jié)果見圖2。

30份野牛草材料經(jīng)過7個引物的擴增共獲得108條條帶，其中多態(tài)性條帶數(shù)目為90條，多態(tài)性比率為83.3%，平均每個引物擴增出條帶15.4條，PIC值的變化范圍為0.78～0.89，平均值是0.85（表2）。所選用的7條引物基本上均能獨立地將30份野牛草區(qū)分開來，這說明不同地理來源的供試野牛草間具有較大的遺傳變異和較豐富的遺傳多態(tài)性，同時表明了ISSR分子標記可以用來檢測野牛草屬種間親緣關(guān)系。

2.3 野牛草種質(zhì)的親緣關(guān)系分析 遺傳相似系數(shù)和遺傳距離是評價群體間、群體內(nèi)DNA變異水平的重要參數(shù)。遺傳相似系數(shù)越大，說明群體間的親緣關(guān)系越近；遺傳相似系數(shù)越小，說明群體間的親緣關(guān)系越遠。

本試驗利用篩選的7條ISSR引物對30份不同地理來源的野牛草基因組DNA進行PCR擴增，共擴出108個位點，通過NTSYS-PC 2.10進行遺傳相似系數(shù)分析。不同地理來源野牛草種質(zhì)資源的GS值變化范圍為0.546～0.880，其中材料22和23、材料30和37的遺傳相似性系數(shù)最高，為0.880，遺傳距離較近；材料3和材料39的遺傳相似性系數(shù)最低，只有0.546，親緣關(guān)系最遠（表3）。

圖1 30份不同地理來源野牛草資源的表型聚類圖Fig.1 Phenotype UPGMA-derived dendrogram of 30 different geographical origin Buchloe dactyloides

圖2 引物TP2聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜Fig.2 Results of PCR amplification with primer TP2

表2 用于ISSR分子標記的引物以及擴增結(jié)果Table 2 The primers and the results of ISSR amplification

2.4 野牛草種質(zhì)的聚類分析 利用ISSR分子標記在遺傳相似系數(shù)為0.690時能將30份野牛草資源分為5類，第Ⅰ大類包括3份材料（1、6、10）；第Ⅱ大類包括20份材料：在遺傳相似系數(shù)為0.710時，第Ⅱ大類材料又分為4個亞類，第1亞類為材料2和材料9，其GS值為0.701，第2亞類共7份材料（3、26、31、32、33、36、38），第3亞類包括8份材料（11、12、13、15、23、24、29、35），第4亞類共3份材料（17、21、28）；第Ⅲ大類包括3份材料（4、18、22）；第Ⅳ大類包括3份材料（7、30、37）；第Ⅴ大類僅為材料39。聚類分析直觀地表明了不同野牛草材料之間的

2.5 野牛草材料的主成分分析 基于GS值，利用NTSYS-PC 2.10軟件對不同地理來源的野牛草材料進行主成分分析，根據(jù)第一、第二主成分作圖（圖4），得到30份野牛草材料的位置分布情況，位置靠近者表示其具有較近的親緣關(guān)系，位置遠離者表示其關(guān)系較遠。將位置靠近者劃在一起，供試野牛草材料大致可以分為5組，即第1組包括材料7、30、37，第2組包括材料4、18、22，第3組包括材料1、3、26、31、32、33、36，第4組包括2、9、11、12、15、17、2 1、23，第5組包括6、10、13、24、28、29、35、38、39。主成分分析結(jié)果與聚類分析結(jié)果基本一致，并且主成分分析結(jié)果在表明不同野牛草材料之間的親緣關(guān)系方面更加直觀。

圖3 30份材料基于遺傳相似系數(shù)的UPGMA聚類圖Fig.3 UPGMA dendrogram based on GS genetic similarity coefficients4

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圖4 30份野牛草材料基于遺傳相似系數(shù)的主成分分析Fig.4 The principal coordinate analysis（PCA）based on genetic similarity coefficients

2.6 結(jié)合田間試驗與分子試驗的結(jié)果分析結(jié)合田間試驗與分子試驗的聚類結(jié)果，下列材料的兩種聚類結(jié)果一致：材料2與材料9在田間試驗中被聚為第Ⅰ大類，在分子試驗中聚為第Ⅱ大類中的第一亞類；材料4、18和22在田間試驗中聚為第Ⅰ大類，在分子試驗中聚為第Ⅲ大類；材料11、12、13、31、32、35和36在田間試驗中聚為第Ⅱ大類，在分子試驗中31、32和36聚為第Ⅱ大類中的第二亞類，11、12、35和13聚為第Ⅱ大類中的第三亞類；材料1 7、21、24和28在田間試驗中聚為第Ⅳ大類，在分子試驗中聚為第Ⅱ大類中的第三亞類。

3 討論

本研究中30份不同地理來源的野牛草單株之間在基本坪用性狀上存在很大差異，其中葉長、葉寬、莖粗、株高、匍匐莖長度和匍匐莖節(jié)數(shù)差異極顯著（P＜0.01），葉色呈現(xiàn)顯著差異（P＜0.05），分蘗數(shù)、匍匐莖數(shù)目和葉片枯黃程度沒有顯著差異。形態(tài)學(xué)指標的差異顯著性分析結(jié)果說明，供試材料間具有豐富的遺傳背景，表型多樣性較好，根據(jù)形態(tài)學(xué)指標能將所有材料聚為4類，這為初步推斷其來源地是否相同提供了直觀的信息，同時為選擇性狀優(yōu)良植株進行育種提供佐證。

分子試驗方面，從ISSR標記的結(jié)果來看，一共得到了108條條帶，90條為多態(tài)性條帶，平均多態(tài)性信息含量為0.850，說明這30份材料具有較豐富的多態(tài)性，同時也說明了ISSR分子標記技術(shù)具有高效、遺傳多態(tài)性高、重復(fù)性好等特點，同時也克服了RAPD重復(fù)性低、AFLP成本高和SSR需要測定重復(fù)序列兩端的序列信息等缺點，表明ISSR分子標記技術(shù)對于分析野牛草的遺傳多樣性方面是有效的，可以用作野牛草育種的輔助工具，同時本研究的結(jié)論為ISSR分子標記技術(shù)在野牛草屬植物上進一步研究中的應(yīng)用奠定了一定的基礎(chǔ)，類似的結(jié)果也出現(xiàn)在其他植物的研究中［13，19-24］。

從之前的研究中發(fā)現(xiàn)，ISSR標記聚類群體與其地理位置的分布有一定的關(guān)系，地理位置接近的多數(shù)材料都聚成一類［25-26］。遺傳距離從一定程度上反映出群體間遺傳差異程度。一般認為材料間的遺傳距離越大，它們產(chǎn)生的雜種優(yōu)勢就有可能越大，但是對于不同作物和牧草，遺傳距離與雜種優(yōu)勢的關(guān)系不同且較為復(fù)雜。本研究利用ISSR標記對30份不同地理來源野牛草的遺傳多樣性聚類分析，遺傳相似性系數(shù)變化范圍為0.546～0.880，其中材料22和23、材料30和37的遺傳相似性系數(shù)最高，為0.880，遺傳距離較近；材料3和材料39的遺傳相似性系數(shù)最低，只有0.546，親緣關(guān)系最遠。通過對遺傳距離的分析可以得出，供試材料之間具有遺傳基礎(chǔ)廣闊、遺傳多樣性豐富的特點。這在主成分分析結(jié)果中也得到了證實，主成分的結(jié)果和聚類結(jié)果大體一致，但是有少部分材料通過兩種分析的結(jié)果不盡相同，大部分材料在空間圖上所處的空間位置較遠，這可能與野牛草復(fù)雜的倍性有關(guān)。Johnson等［27］等研究了美國野牛草主要分布區(qū)域的染色體水平狀況，發(fā)現(xiàn)美國主要分布區(qū)的野牛草的染色體水平主要有二倍體、四倍體、五倍體及六倍體4種類型。其中，六倍體野牛草（73%）是自然分布的主體類型，在采集地均有分布，四倍體野牛草（23%）主要分布在美國的西部地區(qū)，二倍體野牛草（2.6%）的野生種群只分布在墨西哥東部地區(qū)和德克薩斯州西北部，在野外也發(fā)現(xiàn)了少量的五倍體（1.8%）。遺傳距離分析及聚類分析的結(jié)果從分子水平進一步說明了供試種質(zhì)資源間存在豐富的遺傳變異。野牛草植物豐富的遺傳變異為野牛草屬植物的優(yōu)良品系選育、開發(fā)和利用提供了空間，避免了因遺傳基礎(chǔ)狹窄而給育種工作造成的限制。因此，對野牛草屬植物進行深入研究，選育優(yōu)良的新品種具有資源方面的優(yōu)勢也具有開發(fā)潛力。

結(jié)合田間試驗與分子試驗的聚類結(jié)果，有些材料在兩種聚類分析中都聚為一類，表現(xiàn)出了較好的一致性，這些材料地理來源很有可能相同，該結(jié)果為優(yōu)良野牛草種質(zhì)資源的篩選提供了可靠的依據(jù)，同時揭示了不同地理來源野牛草種質(zhì)的遺傳結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系，為野牛草種質(zhì)資源的利用以及保護提供了依據(jù)。

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