張 樺,張富春,曾 光,張 博,陳全家

(1.新疆草地資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046；3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830052)

脯氨酸是植物在逆境中主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，研究表明，在脅迫條件下，脯氨酸不僅是生物大分子的保護(hù)劑或羥基的清除劑，還是植物從逆境脅迫條件中恢復(fù)正常過程中迅速、有效的氮源、碳源和還原劑[1]。生物體內(nèi)，由谷氨酸經(jīng)過兩步連續(xù)的還原后合成脯氨酸,Δ1-二氫吡咯-5-羧酸(P5C)為中間產(chǎn)物，催化該反應(yīng)的酶為Δ1-二氫吡咯-5-羧酸合成酶(Δ1-pyrrline-5-carboxylate synthetase,P5CS,EC2.7.2.11/1.2.1.41)。該酶是雙功能酶，具有γ-谷氨酰激酶和谷氨酰γ-半醛脫氫酶活性，催化從谷氨酸合成脯氨酸的最初兩步反應(yīng)，其活性受脯氨酸反饋抑制[2]。目前已經(jīng)克隆了多種植物Δ′-吡咯琳-5-羧酸合成酶基因，不同植物的P5CS基因在干旱和鹽脅迫下表達(dá)量均上升[3-6]。說明P5CS基因的表達(dá)可以提高植物體內(nèi)脯氨酸的含量，從而減緩脅迫的危害。

苜蓿(Medicagosativa)是世界上分布范圍最廣、種植面積最大的多年生豆科牧草，在我國(guó)也是最重要的牧草之一。在鹽堿地同時(shí)種植苜蓿和啤酒大麥(Hordeumvulgare)，苜蓿的生物量和蛋白質(zhì)產(chǎn)量均高于啤酒大麥，可改良鹽漬化土地。種植苜蓿不僅為動(dòng)物帶來了營(yíng)養(yǎng)豐富的食物，還使原本退化嚴(yán)重的天然草地變成了高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的苜蓿栽培草地，對(duì)恢復(fù)草地生態(tài)具有極其重要的推廣意義[7]。新牧一號(hào)苜蓿(M.variaXinmu-1)是從新疆天山中山帶野生黃花苜蓿(M.falcata)雜種群體中選育而成[8],于1987年育成并進(jìn)行品種登記，登記號(hào)018。經(jīng)推廣后，目前在新疆各地廣泛種植。Wang等[9]對(duì)6種苜蓿的抗旱和抗鹽性進(jìn)行分析，新牧一號(hào)雜花苜蓿在200 mmol·L-1鹽脅迫下發(fā)芽率仍為90%～95%，而其他苜蓿品種發(fā)芽率均低于新牧一號(hào)苜蓿。分析表明，新牧一號(hào)在鹽、PEG脅迫后超氧化物歧化酶(SOD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)表達(dá)量都比敏鹽品種高。王玉祥等[10]綜合比較了新疆6個(gè)品種苜蓿在不同鹽脅迫處理下的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、株高、根長(zhǎng)、可溶性糖含量和丙二醛含量，認(rèn)為新牧一號(hào)抗逆性最強(qiáng)。但其耐鹽能力仍然有限，要在鹽堿地廣泛種植，必須進(jìn)一步提高耐鹽能力。因?yàn)楦彼崾侵参镌谀婢诚轮匾臐B透保護(hù)劑，與植物的抗逆性直接相關(guān)。本研究從克隆新牧一號(hào)苜蓿脯氨酸合成酶基因入手，研究新牧一號(hào)苜蓿P5CS基因的表達(dá)和作用，以期為進(jìn)一步分析苜蓿的耐鹽分子機(jī)制和抗逆分子育種打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1植物材料 新牧一號(hào)苜蓿種子由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)工程學(xué)院提供。

1.1.2試驗(yàn)試劑 TRNzol 總RNA提取試劑，Taq DNA聚合酶試劑盒，凝膠回收試劑盒，DNA Marker購(gòu)自天根生化科技有限公司。反轉(zhuǎn)錄試劑，pMD19-T載體試劑盒，SYBR Green Ⅰ熒光定量試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1總RNA提取和RT-PCR 新牧一號(hào)苜蓿種子室溫萌發(fā)10 d后，150 mmol·L-1NaCl處理過夜，稱取0.1 g葉片于液氮中研磨，參照天根生化科技有限公司的TRNzol試劑盒提取說明書步驟提取總RNA。使用天根公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。引物根據(jù)Genbank中紫花苜蓿相關(guān)基因設(shè)計(jì)序列為P3：ATGGCGAACGCCGACCCTTGTAG，P4：TCAAGTAGTTA GGTCTTTGTGGGTG。參照天根生化科技有限公司的cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄RNA合成cDNA第一鏈，所得cDNA用于PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為cDNA 1 μL，dNTP mixture(10 mmol·L-1each)1 μL，Taq酶(5 U·μL-1)0.5 μL，Taq酶Buffer 2.5 μL，引物各1 μL，去離子水18 μL。PCR程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min后，94 ℃變性1 min，47 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min 30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。瓊脂糖電泳檢測(cè)后按天根生化凝膠回收試劑盒所述方法回收目的條帶。

1.2.2連接、轉(zhuǎn)化、篩選和序列分析 參考TaKaRa產(chǎn)品說明書取pMD19-T 0.5 μL加回收的插入片段4.5 μL，再加入5 μL solution I,16 ℃連接12 h后，全量加入100 μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置30 min，42 ℃加熱45 s后，在冰上放置1 min，加入890 μL LB培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)60 min，涂布于含有Amp的LB平板培養(yǎng)基上，37 ℃過夜，對(duì)菌落進(jìn)行編號(hào)后挑菌落于1 mL含Amp的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)16 h，進(jìn)行菌液PCR，PCR擴(kuò)增體系為菌液1 μL，dNTP mixture(10 mmol·L-1each)1 μL，Taq酶(5 U·μL-1)0.5 μL，Taq酶Buffer 2.5 μL，T載體的m13引物各1 μL，去離子水18 μL。PCR程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min后，94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min 30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。電泳檢測(cè)后對(duì)陽(yáng)性菌液提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切分析，陽(yáng)性克隆分別命名為pMD19-T-MvP5CS，將陽(yáng)性克隆交上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列分析。

1.2.3熒光定量PCR分析MvP5CS的表達(dá) 新牧一號(hào)苜蓿種子發(fā)芽10 d后,用150 mmol·L-1NaCl脅迫,分別在0、1、3、6、12和24 h時(shí)取0.1 g葉片，分別用TRNzol試劑提取總RNA，紫外分光光度法測(cè)含量以定量總RNA，分別反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，根據(jù)在Genbank登錄的苜蓿微管蛋白基因(EU664318STBZ)作為內(nèi)參基因，以此基因部分序列設(shè)計(jì)引物，長(zhǎng)度153 bp，ACT1:CGAGCGTGGATACTCTTTC，ACT2:CCATCAGGCAACTCATAGC；根據(jù)已測(cè)序的MvP5CS基因序列設(shè)計(jì)引物，MvP5CS特異引物長(zhǎng)度262 bp，P5RT1:CTTGGCAATACGAAGTGGGA，P5RT2:AGCATGACCTAGAACAGGGA。

SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR 20 μL反應(yīng)體系：ddH2O 7.2 μL，上下游引物各0.4 μL(10 μmol),SYBR primeEx Tag，上述cDNA樣本1 μL。稀釋cDNA成6個(gè)梯度,得到不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)模板10～106，進(jìn)行靶基因MvNHX1及內(nèi)參基因actin的SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng),反應(yīng)體系加入毛細(xì)管后使用LightCycler 2.0儀器進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s。設(shè)置溫度改變速率均為20 ℃·s-1，循環(huán)45次。制備標(biāo)準(zhǔn)曲線并檢測(cè)擴(kuò)增效率。做溶解曲線分析是否為特異性擴(kuò)增，程序?yàn)?5 ℃ 0 s 20 ℃·s-1;65 ℃ 15 s 20 ℃·s-1;95 ℃ 0 s 0.1 ℃·s-1。以苜蓿actin基因?yàn)閰⒄栈?，檢測(cè)新牧一號(hào)苜蓿樣品中的MvP5CS基因的表達(dá)水平，以0 h樣本為校準(zhǔn)樣本，1～24 h樣本為待測(cè)樣本，比較MvNHX1基因的表達(dá)差異，利用2-ΔΔCt進(jìn)行相對(duì)定量分析，結(jié)果繪制成柱狀圖。

ΔCt0 h=0 hMvNHX1基因Ct值-actin基因Ct值；

ΔCt待測(cè)樣本=待測(cè)樣本MvNHX1基因Ct值-actin基因Ct值；

ΔΔCt=ΔCt待測(cè)樣本-ΔCt0 h；

2-ΔΔCt=2-(ΔCt待測(cè)樣本-ΔCt0 h)。

1.2.4植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-MvP5CS構(gòu)建 在MvP5CS上游引物加BamHI位點(diǎn)，下游引物加PstI位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物，mqP5CS1：CGGGATCCATGGCGAACGCCGACCCTTGTAG，mqP5CS2：GGCTGCAGTCAAGTAGTTAGGTCTTTGTGGGT。用此引物對(duì)pMD19-T-mvP5CS進(jìn)行PCR后回收產(chǎn)物，用BamHI和PstI雙酶切后與同樣雙酶切的植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆。連接轉(zhuǎn)化篩選方法同1.3.2，將陽(yáng)性載體分別命名pCAMBIA2300-MvP5CS。將陽(yáng)性克隆交上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列分析。

1.2.5MvP5CS基因轉(zhuǎn)煙草功能的初步驗(yàn)證 將經(jīng)過鑒定的植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-MvP5CS用液氮凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404。再用葉盤方法轉(zhuǎn)化煙草[11-14]，經(jīng)過煙草葉片預(yù)培養(yǎng)、農(nóng)桿菌侵染、共培養(yǎng)、選擇培養(yǎng)和生根培養(yǎng)，待幼苗長(zhǎng)出根系后，將苗移至盛有無菌土的花盆中。

獲得T0代轉(zhuǎn)基因煙草，并提取轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的基因組DNA，進(jìn)行PCR 檢測(cè)。用MvP5CS基因特異中間片段引物MvP5CS-P3：ATGGCGAACGCCGACCCTTGTAG，MvP5CS-P4：ACTGACTGCGTCGTTCTCGT；nptⅡ上游引物：5′-AGGCTATTCGGCTATGACTGG-3′，nptⅡ下游引物：5′-GCGGTCCGCCACACCCAGCCG-3′，來檢查目的基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)情況。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min后，94 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。

1.2.6轉(zhuǎn)基因煙草T1代的耐鹽性分析 將轉(zhuǎn)基因煙草T1代和非轉(zhuǎn)基因煙草分別播種于含有0、100、150、200、250和300 mmol·L-1NaCl的平皿中，每皿放兩層濾紙，50粒種子，觀察種子的萌發(fā)情況，7 d后觀察并記錄試驗(yàn)結(jié)果。試驗(yàn)分析獲得的所有結(jié)果都在同樣的條件下重復(fù)3次，每次50粒。測(cè)定結(jié)果用SPSS 15.0進(jìn)行方差分析，數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果

2.1MvP5CS的克隆 通過RT-PCR擴(kuò)增,在新牧一號(hào)苜蓿葉片cDNA中擴(kuò)增出1條大小為2 100 bp左右的DNA片段,大小與預(yù)測(cè)相符(圖1)。

圖1 MvP5CS基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

將該片段回收后與pMD19-T載體連接轉(zhuǎn)化，PCR和雙酶切篩選陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性克隆命名為pMD19-T-MvP5CS(圖2)。雙酶切片段與RT-PCR片段大小一致。

圖2 重組質(zhì)粒pMD19-T- MvP5CS的酶切鑒定

2.2MvP5CS的序列分析 序列分析表明(圖3)，MvP5CS全長(zhǎng)2 148 bp，編碼715個(gè)氨基酸。用DNAMAN軟件對(duì)本研究所得序列與GenBank中登記的一些物種P5CS氨基酸序列的相似度進(jìn)行比較,MvP5CS氨基酸序列與紫花苜蓿MsP5CS(X98421)相似度為94.41%，與大豆(Glycinemax)GmP5CS(AY492005)相似度為89.93%，與擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtP5CS(NM201912)相似度為63.88%，與水稻(Oryzasativa)OsP5CS(AY574031)相似度為75.56%，與蕃茄(Solanumlycopersicum)SlP5CS(U60267)相似度為76.71%。氨基酸序列比對(duì)顯示，MvP5CS蛋白都包含有高等植物P5CS蛋白質(zhì)的6個(gè)主要功能域：ATP結(jié)合位點(diǎn)，2個(gè)亮氨酸結(jié)構(gòu)域，NADPH結(jié)合位點(diǎn)，谷氨酰激酶(GK)結(jié)構(gòu)域和谷氨酸半醛(GSA)結(jié)構(gòu)域，說明MvP5CS蛋白在新牧一號(hào)雜花苜蓿脯氨酸合成中起作用。從圖3可以看到，除谷氨酰激酶(GK)結(jié)構(gòu)域和1個(gè)亮氨酸結(jié)構(gòu)域差異較大外，其他4個(gè)功能域的差異都較小，說明P5CS蛋白質(zhì)的主要功能域相對(duì)保守。在MvP5CS的128位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸，說明MvP5CS和其他已發(fā)現(xiàn)的P5CS酶一樣，其活性可能被高濃度脯氨酸抑制。同時(shí)，新牧一號(hào)雜花苜蓿MvP5CS與紫花苜蓿MsP5CS相比，有37個(gè)氨基酸的缺失，這是否與脯氨酸的合成量有關(guān)，還需進(jìn)一步研究。

圖3 MvP5CS氨基酸序列與其他植物P5CS氨基酸序列的比較分析

2.3熒光定量PCR分析MvP5CS的表達(dá) 在RT-PCR擴(kuò)增后進(jìn)行熔解曲線分析(圖4)。從熔解曲線看出，目標(biāo)基因MvP5CS和參照基因actin的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別在82.5和83.5 ℃達(dá)到峰值，無非特異產(chǎn)物和引物二聚體，整個(gè)試驗(yàn)過程沒有污染，目標(biāo)基因和參照基因表達(dá)穩(wěn)定。

圖4 MvP5CS基因和actin熔解曲線

以苜蓿actin基因?yàn)閷?duì)照基因，特異性引物進(jìn)行熒光定量PCR分析MvP5CS基因鹽脅迫下的表達(dá)，采用的是相對(duì)定量2-ΔΔCt法計(jì)算MvP5CS鹽脅迫下的表達(dá)。結(jié)果顯示(圖5)，MvP5CS在鹽脅迫后表達(dá)上調(diào)，12 h前表達(dá)量上升不明顯，到24 h呈顯著上升趨勢(shì)，是脅迫前的31倍，說明苜蓿應(yīng)對(duì)滲透脅迫時(shí)其可溶性滲透物質(zhì)脯氨酸大量累積，使得在受到脅迫時(shí)有效地減輕脅迫，以維持細(xì)胞正常的膨壓，增強(qiáng)苜蓿的抗逆性。

2.4植物表達(dá)載體構(gòu)建 pCAMBIA2300-MvP5CS經(jīng)BamHI和PstI雙酶切后得到2 100 bp左右的片段，與實(shí)際大小一致(圖6)，表明pCAMBIA2300-MvP5CS植物表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.5MvP5CS基因轉(zhuǎn)煙草PCR檢測(cè) 用nptⅡ基因引物和特異引物對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草T0代總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)以非轉(zhuǎn)基因煙草作為對(duì)照。用nptⅡ基因引物檢驗(yàn)MvP5CS基因煙草20棵，轉(zhuǎn)MvP5CS基因煙草有16棵檢測(cè)到了特異性條帶，轉(zhuǎn)化率80%(圖7)。為證明以上獲得的轉(zhuǎn)基因煙草T0代植株是抗卡那霉素的陽(yáng)性煙草植株，又用MvP5CS基因設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增特異中間片段對(duì)已篩選的抗性植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，轉(zhuǎn)MvP5CS基因煙草有15棵檢測(cè)到了特異條帶(圖8)，以上結(jié)果初步證明外源基因已經(jīng)整合到了煙草植株的基因組中。

圖5 MvP5CS基因在鹽脅迫后不同時(shí)間的表達(dá)

圖6 pCAMBIA2300-MvP5CS酶切圖譜

圖7 轉(zhuǎn)基因煙草T0代的nptⅡ基因PCR鑒定

2.6轉(zhuǎn)基因煙草T1代的耐鹽性分析 在無鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)MvP5CS基因煙草T1代植株的長(zhǎng)勢(shì)與非轉(zhuǎn)基因煙草植株的長(zhǎng)勢(shì)沒有較大差異，而在不同濃度鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)MvP5CS基因煙草T1代植株仍能正常生長(zhǎng)，且轉(zhuǎn)基因煙草T1代植株的長(zhǎng)勢(shì)明顯好于非轉(zhuǎn)基因煙草植株，根長(zhǎng)和生物量也明顯高于非轉(zhuǎn)基因煙草植株(圖9)。

圖8 轉(zhuǎn)基因煙草T0代基因中間片段的PCR鑒定

圖9 不同濃度NaCl脅迫對(duì)煙草種子萌發(fā)的影響

正常條件下，轉(zhuǎn)MvP5CS基因煙草T1代植株的萌發(fā)率與非轉(zhuǎn)基因煙草植株的萌發(fā)率基本相同，而在不同濃度NaCl脅迫條件下，轉(zhuǎn)MvP5CS基因煙草T1代植株的萌發(fā)率都顯著高于非轉(zhuǎn)基因煙草植株(圖10)。方差分析表明，轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因植株在鹽脅迫下萌發(fā)率存在顯著差異(P<0.05),說明轉(zhuǎn)MvP5CS基因提高了煙草的耐鹽性。

3 討論

在脅迫條件下，植物中的脯氨酸積累是兩條途徑相互調(diào)控的結(jié)果，既增加了脯氨酸合成酶基因的表達(dá)量，同時(shí)又抑制了脯氨酸降解酶的活性，最終導(dǎo)致脯氨酸含量的增加，從而提高對(duì)脅迫的抗性[15]。已有研究表明，在一定的脅迫范圍內(nèi)，植物可通過自身細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)作用表現(xiàn)出對(duì)外界滲透脅迫的抵抗能力。在滲透脅迫下，植物體內(nèi)會(huì)積累很多滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以維持細(xì)胞正常的膨壓，增強(qiáng)植物的抗逆性。本試驗(yàn)從新牧一號(hào)苜蓿中克隆出MvP5CS基因，通過熒光定量PCR分析在鹽脅迫下0～24 h的MvP5CS基因表達(dá)情況。結(jié)果顯示，MvP5CS基因在鹽脅迫后表達(dá)均上調(diào)，到24 h時(shí)，MvP5CS在鹽脅迫下表達(dá)量是未脅迫時(shí)的31倍，P5CS酶是脯氨酸合成的關(guān)鍵酶，脅迫后大量表達(dá)說明苜蓿響應(yīng)滲透脅迫時(shí)其脯氨酸大量累積可有效地減輕脅迫。將MvP5CS轉(zhuǎn)入煙草，轉(zhuǎn)基因煙草耐鹽性得到提高，進(jìn)一步證明該基因與耐鹽性有關(guān)。

圖10 不同濃度NaCl脅迫下轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因煙草種子的發(fā)芽率

劉旻霞和馬建祖[16]以甘南亞高山草甸植物為研究樣本，分析了不同環(huán)境梯度條件下的6種植物葉片內(nèi)脯氨酸含量，發(fā)現(xiàn)隨著從陰坡、半陰半陽(yáng)坡、陽(yáng)坡環(huán)境的變化，脯氨酸含量都有不同程度的增加；而且植物品種的不同，脯氨酸含量的增加幅度有差異，進(jìn)一步可以認(rèn)為葉片內(nèi)脯氨酸含量的高低可作為衡量植物抗逆性的指標(biāo)。研究表明[17-19]，轉(zhuǎn)P5CS基因植物的脯氨酸含量均高于對(duì)照組，同時(shí)轉(zhuǎn)P5CS基因植物的耐鹽和抗旱性都明顯提高。綜上所述，將外源P5CS基因轉(zhuǎn)入植物中可以提高轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)游離脯氨酸的含量，可以部分改善轉(zhuǎn)基因植物抗脅迫的能力，尤其是耐鹽、抗旱方面的能力。與農(nóng)作物相比，牧草大多種植在生長(zhǎng)條件相對(duì)惡劣的環(huán)境下，因此，培育具有某一或多個(gè)抗逆性的牧草品種，對(duì)改良牧草特性和擴(kuò)大種植面積具有重要作用[20]。

MvP5CS基因的獲得為進(jìn)一步研究新牧一號(hào)苜?？鼓婢趁{迫的機(jī)制提供了理論依據(jù)，也為后續(xù)試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。因?yàn)楦彼岬拇罅亢铣稍诳鼓娣磻?yīng)中起主要作用，但大量的脯氨酸會(huì)反饋抑制P5CS酶的活性，下一步可以通過定點(diǎn)突變法，將MvP5CS中127位的苯丙氨酸突變?yōu)槠渌被幔@樣可以阻止脯氨酸的反饋抑制，從而得到更多的脯氨酸積累以應(yīng)對(duì)脅迫。同時(shí)，該研究成果也可推廣到其他植物，為轉(zhuǎn)基因分子育種提高牧草和作物的抗逆性提供優(yōu)越的基因資源。

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