嚴 萍，張永輝，麥熱姆妮薩·艾麥爾，阿不都克尤木·買買提，烏斯?jié)M·依米提

(新疆大學生命科學與技術學院,新疆 烏魯木齊 830046)

青貯是以新鮮的青飼料為原料，在密閉條件下，利用植物表面自然附生的乳酸菌，通過厭氧發(fā)酵，將植物表面的可溶性碳水化合物轉化為乳酸、乙酸等有機酸，使飼料pH值降低，來抑制霉菌、酵母菌、梭狀芽孢桿菌等腐敗微生物的生長繁殖，通過青貯可以達到保持青飼料營養(yǎng)特性的目的[1-2]。傳統(tǒng)青貯方法以粗鹽為添加劑，采用這種方法制得的青貯飼料品質不佳。

改善青貯發(fā)酵品質方面所利用的添加劑種類較多。目前在各國普遍采用的添加劑有甲酸、乳酸菌制劑和乳酸菌制劑與酶制劑的混合物等。通常認為促進青貯發(fā)酵的乳酸菌為原料上附著的野生乳酸菌，數(shù)量很少，尤其在青貯發(fā)酵過程中起重要作用的乳酸桿菌數(shù)量極少[3]。綠葉汁發(fā)酵液是通過發(fā)酵，大量增殖原料表面附著的野生乳酸菌，從而使青貯發(fā)酵效果更好[4-6]。

新疆是我國最大的牧區(qū)之一，冬季漫長，草地沙漠化嚴重。草地的沙漠化及飼料的季節(jié)供應不足制約著畜牧業(yè)的發(fā)展，青貯工藝可以在很大程度上改善這種制約。本研究采用綠葉汁發(fā)酵液作為青貯添加劑來制作青貯飼料，并測定其發(fā)酵品質，就是建立在新疆特殊氣候條件下，可以極大改善青貯飼料發(fā)酵品質和消化率的發(fā)酵工藝。

1 材料與方法

1.1材料 青貯原料為2009年10月采自新疆吐魯番地區(qū)的蠟熟期收獲的飼料玉米(Zeamays)(新疆飼料玉米一號)；MRS固體培養(yǎng)基用于乳酸菌的計數(shù)；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基用于細菌的計數(shù)；馬丁氏培養(yǎng)基用于真菌的計數(shù)。

1.2儀器與設備 高壓滅菌鍋(上海博迅公司生產(chǎn))，GXZ型智能光照培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠生產(chǎn))，JD200-3 型電子天平(沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司生產(chǎn))，SWCJ-1F 型超凈工作臺(江蘇蘇凈安泰空氣技術有限公司生產(chǎn))，哈納酸度離子計pH211(北京哈納科儀科技有限公司生產(chǎn))，LC-20AD Prominence 島津高效液相色譜儀(島津國際貿易上海有限公司生產(chǎn))及凱氏定氮儀。

1.3綠葉汁發(fā)酵液的制備 稱取新鮮飼料玉米樣品(經(jīng)過切割混勻，長度約為2 cm)200 g，置于1 000 mL 2%的葡萄糖溶液中，每隔4 h測一次OD660 nm值，連續(xù)測48 h，繪制乳酸菌生長曲線圖，得到綠葉汁發(fā)酵液菌落穩(wěn)定期時間，重復稱取飼料玉米樣品200 g，置于1 000 mL 2%葡萄糖溶液中，待菌落達到穩(wěn)定期后，過濾備用。

1.4青貯飼料的制作 提前處理飼料樣品，長度為2～5 cm。按表1的處理方式制作青貯飼料，裝于廣口塑料瓶中(裝填量要保證瓶中基本無空氣)。每個處理做3個重復[7-8]。

表1 青貯飼料處理方式

1.5青貯飼料菌落分布 稱取經(jīng)過切割混勻，長度約為2 cm的青貯飼料樣品20 g ，置于裝有180 mL無菌水的三角瓶中，震蕩30 min后，吸取菌液進行10倍梯度稀釋，得到10-4、10-5、10-63個稀釋度。在細菌培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基和馬丁氏培養(yǎng)基上涂布。30 ℃培養(yǎng)48 h后，用菌落計數(shù)法計數(shù)[9]。

1.6青貯飼料品質鑒定 采用烘干法測定干物質(DM)，即真空干燥箱105 ℃恒溫干燥，稱量；稱取青貯飼料50 g，加450 mL蒸餾水粉碎后，經(jīng)8層紗布過濾，用哈納酸度離子計測定濾液pH值；采用范式洗滌纖維法測定中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)和酸性洗滌木質素(ADL)；采用凱氏定氮法測定粗蛋白(CP)含量[10]。揮發(fā)性脂肪酸采用高效液相色譜法測定[11-15]；消化率采用模擬瘤胃消化試驗法測定，模擬飼料在瘤胃和皺胃中的消化。采集成年健康羊的胃液，經(jīng)澄清過濾后，與緩沖液(緩沖液配方為碳酸氫鈉 9.8 g·L-1、磷酸氫二鈉9.3 g·L-1、氯化鈉0.47 g·L-1、氯化鉀0.57 g·L-1、尿素1 g·L-1、氯化鈣0.04 g·L-1、氯化鎂0.06 g·L-1)以1∶1的體積比混勻(混合前，緩沖液在38 ℃下預熱)。稱取干燥粉碎樣品(過40目)2.000 g放入消化瓶中，在38 ℃下預熱。向消化瓶中加入50 mL配好的消化液，搖動混合，通入氮氣。密封，將消化瓶放入38 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。每6 h測一次產(chǎn)氣量。測定其干物質、酸性洗滌纖維、中性洗滌纖維及粗蛋白消化率[15-17]。

1.7統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進行單因素方差分析。

2 結果

2.1青貯原料的化學成分及微生物數(shù)量 青貯前先對青貯原料的化學成分微生物數(shù)量進行分析，干物質含量72%，pH值7.6，CP、NDF、ADF和ADL含量分別為13.5%、52%、27%和24%，乳酸菌、細菌和真菌數(shù)量分別為3.6×103、7.5×107和1.4×107cfu·g-1。

2.2綠葉汁發(fā)酵液中乳酸菌生長曲線 青飼料在碳源(葡萄糖)充足的狀態(tài)下，乳酸菌經(jīng)過24 h達到穩(wěn)定期，經(jīng)菌落計數(shù)法測定，綠葉汁發(fā)酵液中乳酸菌數(shù)量達到2.49×107cfu·mL-1(圖1)。取此時的綠葉汁發(fā)酵液作添加劑菌體量最大，可以達到最好的效果。

2.3青貯飼料菌落分布 飼料經(jīng)過青貯后乳酸菌數(shù)量明顯增加，由原料中3.6×103cfu·g-1增加為(2.53×105～3.47×106)cfu·g-1，而細菌和真菌的數(shù)量都減少了2個數(shù)量級(表2)。說明青貯后，乳酸菌大量繁殖，產(chǎn)生較多乳酸，從而抑制了細菌和真菌的生長繁殖。添加綠葉汁發(fā)酵液后，乳酸菌菌落數(shù)較對照組及傳統(tǒng)方法組多一個數(shù)量級，說明添加綠葉汁發(fā)酵液可以增加乳酸菌菌落數(shù)，更有利于青貯過程的進行。

表2 青貯飼料菌落分布

2.4青貯飼料品質分析結果 經(jīng)過青貯后，飼料pH值均由7.6降為5.0以下，處理組pH值均顯著低于對照組(P<0.05)；添加綠葉汁發(fā)酵液與傳統(tǒng)加鹽方法相比pH值也顯著降低(表3)。除添加1.0%發(fā)酵液3% NaCl處理外，其他處理組乳酸含量均顯著高于對照組，且添加1.5%和2.0%綠葉汁發(fā)酵液的青貯飼料乳酸含量顯著高于傳統(tǒng)加鹽組。傳統(tǒng)加鹽組、添加1.0%發(fā)酵液與對照組乙酸含量無顯著性差異(P>0.05)，添加1.5%和2.0%綠葉汁發(fā)酵液組顯著高于與對照組和傳統(tǒng)加鹽組。除添加1.0%發(fā)酵液和3% NaCl處理組外，其余處理組總酸含量均顯著高于對照組，且添加1.5%和2.0%綠葉汁發(fā)酵液組顯著高于傳統(tǒng)加鹽組(表3)。

2.5青貯飼料化學成分 經(jīng)過青貯后，飼料干物質量、CP含量有所增加。發(fā)酵液處理組干物質含量顯著高于對照組與加鹽組(P<0.05);加鹽組干物質含量均與對照組差異不顯著(P>0.05)；1.0%發(fā)酵液處理組CP含量顯著高于對照組，3% NaCl組顯著低于對照組，其余各組與對照無顯著差異，各發(fā)酵液組的ADF含量及NDF含量與對照組相比，顯著低于對照組；添加1.5%、2.0%發(fā)酵液處理組NDF含量顯著低于對照；除2.0%發(fā)酵液和1% NaCl處理組ADL含量顯著低于對照組外，其余各處理組均與對照組無顯著差異(表4)。

2.6體外消化率結果 除3% NaCl處理組外，其他處理組NDF、ADF消化率均顯著高于對照組(P<0.05)；1.5%發(fā)酵液及1% NaCl處理組的CP消化率顯著高于對照組，1.0%發(fā)酵液、2.0%發(fā)酵液、3% NaCl差異不顯著(P>0.05)；處理組干物質消化率高于對照組，1.0%發(fā)酵液、1.5%發(fā)酵液、1% NaCl、3% NaCl與對照組相比差異不顯著(表5)。

表3 不同青貯處理對飼料發(fā)酵品質的影響

表4 不同青貯處理對飼料化學成分的影響

表5 不同青貯處理對體外消化率的影響

3 討論

新疆畜牧業(yè)發(fā)展的總體目標是大力發(fā)展牛、羊等草食家畜，逐步形成一個“節(jié)糧型” 畜牧業(yè)結構。從我國農(nóng)業(yè)整體發(fā)展戰(zhàn)略考慮，發(fā)展草食家畜主要依靠農(nóng)區(qū)，飼用玉米種植面積在近10年內將會發(fā)展到全疆玉米種植面積的15%～20%[18]。飼料玉米具有高產(chǎn)、多汁清香，適口性好、纖維素含量低、利于消化等優(yōu)點。但飼料玉米碳水化合物含量較少，未能滿足優(yōu)質青貯飼料所需的8%～10%含量[19],本研究通過添加葡萄糖來提高碳水化合物含量，以保證青貯過程順利進行。一般情況下，植物體表面附著乳酸菌數(shù)量不足，主要是異型發(fā)酵乳酸菌，同時包括大量不良菌種(霉菌、酵母菌和丁酸菌)。若乳酸菌數(shù)量不足，青貯初期乳酸菌繁殖緩慢，不能有效抑制有害微生物增殖，要使乳酸菌快速繁殖并占據(jù)優(yōu)勢地位，理論上要求每克青貯飼料上附著的乳酸菌菌落數(shù)必需在105個以上[20]。本研究通過添加綠葉汁發(fā)酵液使乳酸菌數(shù)量達到要求數(shù)量，保證青貯初期發(fā)酵所需足夠的乳酸菌數(shù)量，通過乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸降低pH值，抑制有害微生物的生長繁殖，保持青飼料的營養(yǎng)價值。

徐慶方等[21]研究結果表明，添加綠葉汁發(fā)酵液青貯后，pH值降低至4.32以下，乳酸含量增加至6.26%。經(jīng)品質測定結果可知，在添加綠葉汁發(fā)酵液及葡萄糖后，青貯飼料的發(fā)酵品質比對照組及傳統(tǒng)青貯方法組有明顯改善，pH值降低至4.0以下，乳酸、乙酸含量增加，特別是添加2.0%乳酸菌發(fā)酵液組pH值低于3.5以下。有害菌數(shù)量減少，乳酸菌數(shù)量增加至3.47×106cfu·g-1，干物質含量、粗蛋白含量以及有機酸含量都有較大程度的提高。

通過試驗結果初步確定了綠葉汁發(fā)酵液的最佳添加濃度，同時進一步了解到綠葉汁發(fā)酵液可以提高青貯飼料干物質、粗蛋白、中性洗滌纖維素及酸性洗滌纖維素消化率，比起傳統(tǒng)青貯方法，添加綠葉汁發(fā)酵液可以改善青貯品質，抑制有害微生物的繁殖，減少營養(yǎng)物質的流失，提高干物質，粗蛋白和纖維素的消化率，從而提高青貯飼料利用率，緩解飼料季節(jié)性供應不足的問題。本研究為生產(chǎn)高品質青貯飼料技術提供一定的理論和科學依據(jù)。

[1]孫磊.乳酸菌青貯劑的研究[D].濟南：山東大學，2005：37-39.

[2]王蔚淼.青貯飼料中乳酸菌的鑒定及生物學特性的研究[D].合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學，2006：25-26.

[3]王金娥.不同添加劑對紫花苜蓿青貯品質的影響[D].北京：中國農(nóng)業(yè)大學，2005：3-8.

[4]玉柱,韓建國.綠汁發(fā)酵液對豆科牧草青貯發(fā)酵品質的影響[A].現(xiàn)代草業(yè)科學進展[C].北京:中國草學會,2002：159-161.

[5]傅彤，刁其玉.微生物接種劑對玉米青貯飼料發(fā)酵進程及其品質的影響[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學院，2005：3-10.

[6]馬蘭芳.玉米秸稈的青貯及利用[J].甘肅農(nóng)業(yè),2010(7)：92-94.

[7]Whiter A G,Kung L Jr.The effcet of a dry or liquid application of Lactobacillus plantarum MTD1 on the fermentation of alfalfa silige[J].Dairy Science,2001,84:2195-2202.

[8]Yimiti W，Yahaya M S，Kawamoto Y.Effects of amino acids fermentation by-product on fermantation quality and in situ ruman degradability of Italian ryegrass silage[J]. Faculty of Bioresources,2004(1):633-637.

[9]玉柱，白春生，孫啟忠.不同添加劑對無芒雀麥青貯品質的影響[J].中國農(nóng)業(yè)科技導報，2008,10(4)：76-81.

[10]楊勝．飼料分析及飼料質量檢測技術[M]．北京：農(nóng)業(yè)出版社，1999：23-25.

[11]王佳彤，劉園園，張磊，等.不同微生物處理的秸稈飼料體外消化率的比較[J].飼料工業(yè)，2008，29(23)：27-29.

[12]李希茜，韓建國，玉柱.添加劑對紫花苜蓿青貯發(fā)酵品質和體外消化率的影響[J].中國奶牛，2009(8)：20-22.

[13]孫娟娟，玉柱，薛艷玲，等.添加劑對羊草青貯發(fā)酵品質和體外消化率的影響[J].草地學報，2007，15(3)：238-240.

[14]黎麗，馮樹丹，李蕊沁，等.三江濕地典型植被的葉片氮含量與比葉面積關系的研究[J].哈爾濱師范大學自然科學學報，2010，26(1)：94-96.

[15]張彥鳳，郭治安，趙景嬋，等.高效液相色譜法測定生物除臭劑中4種有機酸[J].理化檢驗，2009，45：365-367.

[16]于秀芳，劉海燕，于維.玉米秸稈及青貯飼料的細胞壁成分體外消化性能比較[J].中國畜牧獸醫(yī)，2008，35(5)：155-156.

[17]玉柱，魏馨，于艷東，等.添加劑對尖葉胡枝子青貯發(fā)酵品質及體外消化率的影響[J].草業(yè)學報，2009，10(5)：73-79.

[18]王婷，李永剛.關于新疆大戰(zhàn)專用青貯飼用玉米的思考[J].草食家畜，2010,6(2):61-62.

[19]劉建新，楊振海.青貯飼料的合理調制與質量評定標準[J].飼料工業(yè)，1999，20(3)：4-7.

[20]Tengerdy R P,Weinberg Z G,Szakacs G,etal.Ensiling alfalfa with additives of lactic acid bacteria and enzymes [J].Journal of the Science of Food and Agriculture,1991,55:215-228.

[21]徐慶方，玉柱，李勝利，等.甲酸或綠葉汁發(fā)酵液對苜蓿青貯影響的研究[J].畜牧獸醫(yī)學報，2008,39(12)：1709-1714.