許文志,張新全,黃琳凱,馬 嘯

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，四川 雅安 625014)

柳枝稷(Panicumvirgatum)為禾本科黍?qū)俨荼局参?，起源于北美洛基山脈以東、55° N以南的大草原，是一種植株高大、多年生暖季型叢生C4植物，通常被用于放牧、水土保持以及生態(tài)建設(shè)等[1]。柳枝稷生產(chǎn)量大，根系發(fā)達，耐貧瘠、洪澇和干旱，能夠抵抗多種病蟲害，易于收割貯存[2]，能夠用于生產(chǎn)能源等特性，因此，國內(nèi)外許多學(xué)者認(rèn)為柳枝稷是一種具有較大發(fā)展?jié)摿Φ哪茉醋魑颷3-4]。在美國，柳枝稷作為一種模式能源作物，對其的研究方興未艾[5]。其中，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)增強柳枝稷的抗逆性、提高光合效率、增加生物產(chǎn)量、降低木質(zhì)素含量和提高乙醇產(chǎn)率等方面已成為目前的研究熱點[6]。為此，研究并創(chuàng)建較為高效的組織培養(yǎng)體系是遺傳轉(zhuǎn)化體系建立的基礎(chǔ)和前提。本研究以柳枝稷成熟種子為外植體，采用兩步法滅菌，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，研究不同質(zhì)量濃度2,4-D與6-BA組合對愈傷組織誘導(dǎo)的影響，不同質(zhì)量濃度GA3對愈傷組織分化的影響，以期建立穩(wěn)定的柳枝稷組織培養(yǎng)體系。

1 材料與方法

1.1試驗材料及處理 試驗材料為美國弗吉尼亞理工大學(xué)提供的高轉(zhuǎn)化率柳枝稷材料HR8的成熟種子，該材料是從Alamo中經(jīng)過篩選得到。取脫殼后的柳枝稷種子，用自來水沖洗，去掉雜質(zhì)，再用自來水浸泡12 h，沖洗后置于4 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.2方法

1.2.1種子滅菌試驗 取處理后4 ℃保存的種子，用濾紙吸干表面水分，稱取9份，每份10 g。以兩步法對種子進行滅菌，即先用70%乙醇處理一定時間，用無菌蒸餾水沖洗后，再用0.1% HgCl2處理，兩步處理完成后再用無菌蒸餾水充分洗滌種子3次(表1)。

滅菌處理后的種子接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基組成為MS、5 mg·L-12,4-D、0.15 mg·L-16-BA、3%蔗糖和0.5%瓊脂。每種處理組合的培養(yǎng)皿中接種50粒種子，5次重復(fù)。培養(yǎng)皿置于25 ℃黑暗培養(yǎng)，每隔3 d觀察一次，記錄發(fā)芽種子數(shù)、出愈種子數(shù)、污染種子數(shù)，以發(fā)芽及出愈的種子為存活種子，計算種子存活率及出愈率。

1.2.2培養(yǎng)基配置 以MS為基本培養(yǎng)基，根據(jù)試驗設(shè)計的各種組合附加不同種類及濃度的激素，同時調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中瓊脂、蔗糖含量，然后將培養(yǎng)基pH值調(diào)至6.0。最后在121～126 ℃下高壓滅菌20 min，移于接種室備用。

1.2.3愈傷組織誘導(dǎo) 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+2,4-D+6-BA組成9種2,4-D與6-BA不同質(zhì)量濃度組合的培養(yǎng)基(表1)。每種培養(yǎng)基附加0.7%瓊脂和3%蔗糖。

表1 種子滅菌處理時間和愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基激素濃度

每種組合的培養(yǎng)基接種滅菌后的種子50粒，8次重復(fù)，置于(23±1) ℃黑暗培養(yǎng)。培養(yǎng)4 d后，每天觀察并記錄出愈情況，包括愈傷組織生長速度、數(shù)目、形態(tài)特征、顏色變化等，統(tǒng)計愈傷組織數(shù)。

1.2.4繼代培養(yǎng) 繼代培養(yǎng)基：MS+2,4-D(3、4、5 mg·L-1)3種不同的培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基附加0.8%瓊脂和3%蔗糖。分裝至三角瓶中，以封口膜封口，滅菌后備用。

選取愈傷組織色澤淡黃而純凈、表面干燥、緊實、體積較大的出愈種子，在無菌條件下剝離出愈傷組織，接種于繼代培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基分別接種15瓶，每瓶接種2～3塊愈傷組織。置于(23±1) ℃黑暗培養(yǎng)，每天記錄愈傷組織生長速度、形態(tài)特征、顏色變化等。

1.2.5分化培養(yǎng) 分化培養(yǎng)基：MS+GA3(0.1、0.2、0.5、1.0 mg·L-1)4種不同的培養(yǎng)基。每種培養(yǎng)基附加0.7%瓊脂和3%蔗糖，滅菌后再加入已過濾除菌的激素。

選取愈傷組織色澤淡黃而純凈、表面干燥、緊實、體積較大的愈傷組織塊，接種于分化培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基分別接種15瓶，每瓶接種2～3塊愈傷組織。置于27 ℃、光照16 h·d-1、光照強度為10 000 lx及溫度25 ℃、黑暗8 h·d-1變溫培養(yǎng)。每天記錄愈傷組織形態(tài)特征、顏色變化、出芽數(shù)、幼芽形態(tài)特征及幼芽高度。

分化培養(yǎng)14 d后，將生長有幼芽的愈傷組織塊取出，無菌條件下在培養(yǎng)皿中用濾紙吸掉愈傷組織塊表面培養(yǎng)基，然后轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基中。生根培養(yǎng)基為1/2 MS附加0.7%瓊脂和3%蔗糖。

1.3數(shù)據(jù)分析 每日觀察記錄的數(shù)據(jù)，經(jīng)匯總后，分別按照以下公式計算：

所得結(jié)果用Excel 2003進行F檢驗，用SPSS 17.0進行多重比較。

2 結(jié)果

2.1種子滅菌效果 成熟種子在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，3 d后大部分種子開始出芽。6 d后，部分種子盾片處長出白色水浸狀、柔軟松散的愈傷組織，并且少量未發(fā)芽的種子也有愈傷組織長出；同時，極少量種子四周有乳白色液體滲出至培養(yǎng)基表面，此為種子滅菌不徹底所致。帶菌種子只出現(xiàn)在70%乙醇10 s、0.1% HgCl25 min處理和70%乙醇10 s、0.1% HgCl215 min處理的部分培養(yǎng)皿中，兩處理帶菌種子數(shù)平均都為1粒。15 d后，芽生長明顯，愈傷組織變大且表面變干燥、質(zhì)地變緊實，帶菌種子芽腐爛且四周菌斑變大，沒有發(fā)芽也沒長出愈傷組織的種子不再有變化，證明種子已經(jīng)死亡。記錄15 d時各培養(yǎng)皿發(fā)芽種子數(shù)及出愈種子數(shù)，計算種子存活率及出愈率(圖1)。

F檢驗(兩因素三水平)表明，70%乙醇處理對種子存活率的影響達到顯著水平(F=3.84)；0.1%HgCl2處理對出愈率影響顯著(F=4.47)。只有70%乙醇10 s、0.1% HgCl25 min處理和70%乙醇10 s、0.1% HgCl215 min處理有少量種子帶菌，即0.1% HgCl2處理5 min、70%乙醇處理時間分別為10和15 s，其他各處理均無帶菌種子，說明已經(jīng)滅菌徹底。各處理種子存活率及出愈率最高的均為70%乙醇20 s、0.1% HgCl25 min處理，分別為75%和30%。在種子徹底滅菌的同時，要獲得較多的愈傷組織，應(yīng)先用70%乙醇處理20 s，用無菌蒸餾水沖洗后，再用0.1% HgCl2處理5 min，處理完成后再用無菌蒸餾水充分洗滌種子3次。

圖1 滅菌時間對種子存活率和出愈率的影響

2.2愈傷組織誘導(dǎo) 經(jīng)70%乙醇處理20 s，0.1% HgCl2處理5 min的成熟種子，大多數(shù)能在各愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基發(fā)芽生長。培養(yǎng)4 d后，逐漸長出愈傷組織，隨后愈傷組織變大且表面變干燥、質(zhì)地變緊實(圖2)。培養(yǎng)21 d后，存活種子全部長出愈傷組織，其中大部分愈傷組織色澤淡黃而純凈、

圖2 不同愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基出愈率及有效出愈率

表面干燥、緊實、體積較大，為質(zhì)量較好，具有分化潛力的愈傷組織塊。統(tǒng)計出愈種子數(shù)及愈傷組織質(zhì)量較好的出愈種子數(shù)，計算出愈率及有效出愈率。

各處理出愈率差別不明顯，最大的88%，最小的81%。有效出愈率差別較大，最大的70%，最小的42%。為了得到足夠多的高質(zhì)量愈傷組織，采用MS+5 mg·L-12,4-D+1.2 mg·L-16-BA，附加0.7%瓊脂和3%蔗糖的培養(yǎng)基配方進行愈傷組織誘導(dǎo)。

2.3繼代培養(yǎng) 愈傷組織塊繼代培養(yǎng)7 d后，大部分愈傷組織塊增大，色澤內(nèi)部淡黃表面白色，緊實而干燥。個別愈傷組織塊表面有油狀物，結(jié)構(gòu)松散，且隨機出現(xiàn)在各三角瓶內(nèi)。其中在附加4 mg·L-12,4-D的培養(yǎng)基上，愈傷組織塊增大明顯，表面出現(xiàn)白色顆粒狀凸起。培養(yǎng)14 d后，附加4 mg·L-12,4-D的培養(yǎng)基上，大部分愈傷組織塊長到原來體積的兩倍大小，表面干燥，結(jié)構(gòu)緊實。附加3 mg·L-12,4-D的培養(yǎng)基上，只有少量愈傷組織塊體積顯著增大，大部分增大不明顯，表面具油狀物結(jié)構(gòu)松散的愈傷組織塊比附加4和5 mg·L-12,4-D的兩種培養(yǎng)基都多。附加5 mg·L-12,4-D的培養(yǎng)基上，部分愈傷組織塊出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。培養(yǎng)28 d后，各三角瓶內(nèi)愈傷組織塊均發(fā)生不同程度的褐化。綜合考慮，附加4 mg·L-12,4-D、0.8%瓊脂、3%蔗糖的MS為最佳繼代培養(yǎng)基。繼代14 d后再次繼代處理，或者轉(zhuǎn)接至分化培養(yǎng)基進行分化。一次繼代連續(xù)培養(yǎng)超過21 d后，愈傷組織出現(xiàn)褐化，分化成苗的能力降低。

2.4分化培養(yǎng) 愈傷組織塊在分化培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)。7 d后，白色顆粒狀凸起即可出現(xiàn)綠色的芽點。14 d后，部分綠色芽點分化成苗，每塊愈傷組織平均7個苗，平均1.3 cm高，新芽顏色嫩綠直立向上生長；部分愈傷組織塊上的綠色芽點沒有變化，且周圍開始褐化。還有部分愈傷組織塊嚴(yán)重褐化，表面變堅硬。添加不同質(zhì)量濃度GA3的各培養(yǎng)基上，分化出芽的愈傷組織數(shù)不同(圖3)。隨著GA3質(zhì)量濃度逐漸增加，愈傷組織的分化率逐漸提高，添加0.5 mg·L-1GA3時，分化率最大，為30.56%。當(dāng)添加的GA3質(zhì)量濃度超過0.5 mg·L-1后，愈傷組織分化率下降。因此，應(yīng)選擇添加0.5 mg·L-1GA3的MS作為分化培養(yǎng)基。

圖3 愈傷組織分化率

將分化出芽的愈傷組織塊轉(zhuǎn)接至1/2 MS附加0.7%瓊脂、3%蔗糖的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)。部分原來帶有須根的愈傷組織塊幼芽繼續(xù)生長，且逐漸長出少量根；部分原來沒有須根可見的愈傷組織塊，幼芽生長緩慢，但根系生長較快較多；還有一部分有幼芽的愈傷組織塊不能生根，幼芽生長數(shù)天后開始失水。

待愈傷組織塊生根后，去掉培養(yǎng)瓶的封口膜，在培養(yǎng)基表面加入少量無菌水，形成水膜防菌。置于室溫光照培養(yǎng)3 d，每天更換一次無菌水。3 d后，將苗取出，沖洗干凈培養(yǎng)基，移栽至經(jīng)過滅菌處理的沙土盆中，置于室溫光照培養(yǎng)。待煉苗結(jié)束后，即可搬至室外培養(yǎng)。大部分苗可以長成完整植株且健康生長，少量苗在移栽后其根部逐漸腐爛，幼苗逐漸死亡。

3 討論

3.1HgCl2對種子活力的影響 采用兩步法滅菌，處理適當(dāng)，可達到徹底滅菌的效果[7-8]。HgCl2對種子有一定的毒害作用，處理時間過長，會使部分種子失去活力，無法發(fā)芽，也不能誘導(dǎo)出愈傷組織[9]。因此，既要最大可能保存種子活力又要達到徹底滅菌的目的，應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)臐舛龋幚磉m當(dāng)?shù)臅r間。在試驗中，用HgCl2處理后，要用無菌水反復(fù)沖洗種子，防止殘留的HgCl2繼續(xù)毒害種子。用HgCl2處理甜蕎(Fagopyrumesculentum)時，滅菌效果很好，但種子萌發(fā)率顯著降低[10]；用HgCl2處理日本結(jié)縷草(Zoysiajaponica)后再用無菌水多次沖洗，可以降低HgCl2對種子的毒害[11]，這與本研究結(jié)果一致。

3.2激素對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 2,4-D對植物愈傷組織誘導(dǎo)起決定作用[12-14]。在培養(yǎng)基中添加2,4-D可以提高植物細胞生長素含量，從而誘導(dǎo)胚性細胞的生長，誘導(dǎo)出愈傷組織[15]。在一定范圍內(nèi)，隨著2,4-D質(zhì)量濃度的增加，誘導(dǎo)率增高。Linaeero和Vazquez[16]指出，過高或過低濃度的2,4-D都不利于愈傷組織的形成和分化再生，過高濃度的2，4-D處理易引起愈傷組織褐化死亡。本研究表明，5 mg·L-12,4-D對柳枝稷成熟種子的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，偏高或者偏低的濃度，對愈傷組織的誘導(dǎo)都不利。

在植物愈傷組織誘導(dǎo)過程中，添加一定量的細胞分裂素，如6-BA，可改良愈傷組織的質(zhì)量，從而提高植物分化再生頻率[17-18]。楊茹等[19]指出，在已有2,4-D的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入少量的BA能對愈傷組織的誘導(dǎo)產(chǎn)生促進作用。本研究中，添加6-BA對柳枝稷愈傷組織誘導(dǎo)率并無顯著影響，但是可以明顯改善愈傷組織的質(zhì)量，并且添加1.2 mg·L-16-BA效果最佳，這與Somleva等[20]在柳枝稷轉(zhuǎn)基因研究中所使用的濃度一致，但與孟敏等[21]以幼穗為外植體研究柳枝稷再生時使用0.15 mg·L-16-BA有很大差異，這可能是由于所采用的品種不同，所取外植體部位也不同。

另外，還有其他因素也影響柳枝稷種子愈傷組織的誘導(dǎo)，如種子的品質(zhì)、品種等[22]。同一品種中，成熟完全、顆粒飽滿的種子，愈傷組織誘導(dǎo)率較高，且愈傷組織質(zhì)量較好，容易分化成苗；瘦癟的種子，愈傷組織誘導(dǎo)率低，且愈傷組織質(zhì)量較差，不易繼代增殖，無法分化成苗。不同品種的種子由于其遺傳物質(zhì)存在差異，內(nèi)源激素組成不同，對外源激素的響應(yīng)也不同。影響柳枝稷愈傷組織誘導(dǎo)的其他因素還有待進一步試驗研究。

3.3愈傷組織分化的影響因素 愈傷組織的質(zhì)量為影響其分化的主要因素。愈傷組織塊較干燥、色澤內(nèi)部淡黃外表白色、結(jié)構(gòu)緊實、表面有白色顆粒狀凸起的愈傷組織容易分化成苗。一般在白色凸起的部位先呈現(xiàn)綠色，最后發(fā)育成芽。表面濕潤、松軟的愈傷組織塊不易分化出芽。顏色暗黃的愈傷組織塊在光照下極易褐化，不具有分化能力。因此，在進行柳枝稷遺傳改良及其他處理時，應(yīng)選擇狀態(tài)良好的愈傷組織塊。

2,4-D對愈傷組織的分化有一定的抑制作用[23]。在柳枝稷愈傷組織誘導(dǎo)階段添加7 mg·L-12,4-D的愈傷組織塊，繼代一次后進行分化，與添加低濃度2,4-D誘導(dǎo)的愈傷組織相比，不易分化成苗。但是將所有愈傷組織繼代3次以后，誘導(dǎo)階段添加不同濃度2,4-D的愈傷組織塊分化能力并無明顯差別。因為繼代培養(yǎng)基均添加4 mg·L-12,4-D，已經(jīng)消除了前期2,4-D濃度差異的影響。

繼代培養(yǎng)的時間也可影響愈傷組織的分化。繼代3次，培養(yǎng)45 d以內(nèi)，愈傷組織持續(xù)增大，質(zhì)量較好。超過45 d后，愈傷組織有的開始褐化，有的變得堅硬，兩種狀態(tài)的愈傷組織塊均無法再分化。

4 結(jié)論

以柳枝稷成熟種子為外植體，先用70%乙醇處理20 s，再用0.1% HgCl2處理5 min；滅菌后的種子接種于MS+5 mg·L-12,4-D+1.2 mg·L-16-BA+0.7%瓊脂+3%蔗糖的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；21 d后，將愈傷組織轉(zhuǎn)接于MS+4 mg·L-12,4-D+0.8%瓊脂+3%蔗糖的繼代培養(yǎng)基上繼代2～3次；然后轉(zhuǎn)接在MS+0.5 mg·L-1GA3+0.7%瓊脂+3%蔗糖的分化培養(yǎng)基上，14 d后即有苗長出；最后在1/2 MS上誘導(dǎo)生根，室內(nèi)煉苗1周后，移栽至沙土中，可以很好地發(fā)育成苗。

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