王清酈，孫啟忠，趙淑芬，郭艷艷，周國(guó)棟

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；3.林西縣草原工作站，內(nèi)蒙古 林西 025025； 4.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019)

尖葉胡枝子(Lespedezahedysaroides)為中旱生草本小半灌木，在森林和森林草原帶的草甸草原群落中為優(yōu)勢(shì)種或伴生種，或?yàn)椴菰瓗У纳降毓鄥舶樯煞?，常見于草甸草原帶的丘陵坡地、沙質(zhì)地上或林緣[1-2]。尖葉胡枝子具有抗旱、耐寒、耐瘠薄及適應(yīng)性廣等特性，是荒地造林、水土保持和土壤改良的先鋒植物，并且具有返青早、枯黃晚、葉量大、花期長(zhǎng)、泌蜜量大、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、再生能力強(qiáng)、適口性好等特點(diǎn)，可用作飼料、薪炭林、蜜源植物和藥用植物[3-5]。

種子貯藏蛋白(Seed Storage Proteins，SSP)，是指高等植物在種子成熟過程中合成并大量貯存的貯藏蛋白質(zhì)，為植物的生長(zhǎng)發(fā)育提供重要的碳源、氮源和硫源。貯藏蛋白質(zhì)占種子總蛋白含量的60%～80%，豆科植物中總蛋白含量較高，已成為人類除肉類外重要的蛋白質(zhì)來源[6-8]。種子貯藏蛋白根據(jù)溶解特性可分為四大類，即溶于水的清蛋白、鹽溶蛋白(包括白蛋白和球蛋白)、醇溶蛋白和溶于稀酸或稀堿溶液的谷蛋白。蛋白的組成由基因決定、幾乎不受外界環(huán)境的影響，蛋白組分的差異可以反映出基因型的不同，因此，種子貯藏蛋白也被稱為生化“指紋”[9]。研究種子貯藏蛋白的方法有多種，蛋白質(zhì)電泳譜帶具有較高的多態(tài)性、專一性和穩(wěn)定性，在植物的生化水平遺傳多樣性研究、品種鑒定、種群或居群間的遺傳變異以及遺傳結(jié)構(gòu)的研究等方面得到了廣泛應(yīng)用[10-11]。十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)因其多種優(yōu)良特性而得到研究者的青睞，如電泳速度只與分子量大小有關(guān)、電泳結(jié)果穩(wěn)定、不受貯藏年限和外界環(huán)境影響等[12-13]。本試驗(yàn)采用SDS-PAGE電泳技術(shù)對(duì)3個(gè)不同類型尖葉胡枝子的種子貯藏蛋白進(jìn)行比較研究，從生化水平上探討尖葉胡枝子的遺傳多樣性，從而了解胡枝子屬的遺傳背景，以期為胡枝子屬種質(zhì)資源的研究和合理開發(fā)利用提供方法依據(jù)[14]。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)區(qū)自然概況 試驗(yàn)地設(shè)在赤峰市林西縣城北5 km處的農(nóng)研場(chǎng)。海拔900 m，屬于半干旱大陸性季風(fēng)氣候；年均氣溫4～5 ℃，7月最熱，平均氣溫20～22 ℃，極端最高氣溫40.4 ℃，1月最冷，平均氣溫-17～-13 ℃，極端最低氣溫-32.2 ℃，≥10 ℃積溫2 600 ℃·d，年均日照時(shí)數(shù)2 985.9 h；年均降水量320～380 mm，降水主要集中在6-8月，占全年的76.7%，年蒸發(fā)量1 800 mm以上，是降水量的4.95倍；無霜期125～130 d；土壤為栗鈣土。

1.2試驗(yàn)材料 供試材料為尖葉胡枝子，有3個(gè)不同類型，其中一個(gè)類型是已經(jīng)通過審查登記的品種科爾沁尖葉胡枝子，另外2個(gè)類型是在科爾沁尖葉胡枝子多年的栽培過程中發(fā)現(xiàn)的具有穩(wěn)定遺傳的種群分化類型。以科爾沁尖葉胡枝子自命名為普通型，其他兩種根據(jù)形態(tài)特性自命名為濃綠型和高桿型。于2008年6月3日播種，播種量為6.0 kg·hm-2。行距45 cm，開溝溜種，覆土1.5～2.0 cm。苗期除草2次，播種當(dāng)年澆凍水，第2年返青后除草2遍。

1.3試驗(yàn)方法 采用SDS-PAGE垂直平板電泳方法，具體操作參照《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)》[15]。分別對(duì)各類種子貯藏蛋白(清蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白和鹽溶蛋白)及總貯藏蛋白進(jìn)行電泳分析。

1.3.1種子貯藏蛋白的提取 不同溶劑的蛋白質(zhì)提取液配方及用量：①清蛋白提取液：去離子水，提取用量350 μL；②鹽溶蛋白提取液：0.25 mmol·L-1Na3PO4、2 mol·L-1NaCl，pH值7.0，提取用量350 μL；③醇溶蛋白提取液：75%乙醇溶液，提取用量350 μL；④谷蛋白提取液：0.2%NaOH溶液，提取用量350 μL；⑤貯藏蛋白提取液：5 mL 10%SDS，1.5 mL 2-ME，1.25 g溴酚蘭，3.44 mL甘油，2.0 mL 1 mol·L-1Tris-HCl，pH值 6.8，加雙蒸水定容到25 mL，提取用量350 μL。

取20粒種子洗凈擦干，放入研缽中研碎，置于1.5 mL離心管中，加入上述配置的蛋白提取液[16-18][其中鹽溶蛋白在加提取液之前需要進(jìn)行前處理：在加有研碎種子的離心管中加入200 μL脫脂劑(氯仿∶甲醇∶丙酮=2∶1∶1)，振蕩混勻，常溫下脫脂2 h，10 000 r·min-1離心10 min，棄上清后備用，待加鹽溶蛋白提取液]。室溫振蕩浸提2 h，10 000 r·min-1離心10 min，取上清液置于4 ℃冰箱備用。以1∶1的比例加入上樣緩沖液，煮沸5 min后點(diǎn)樣。

1.3.2SDS-PAGE電泳 SDS-PAGE的濃縮膠濃度3%，分離膠濃度12%。各類貯藏蛋白及總的貯藏蛋白的上樣量15 μL，標(biāo)準(zhǔn)蛋白D532S(分子量6.5～200 kDa)，上樣量5 μL，用北京六一電泳儀器廠生產(chǎn)的DYZ-28B型電泳槽，濃縮時(shí)電壓恒壓200 V，分離時(shí)電流恒流60 mA電泳，室溫下電泳約7 h，至指示劑跑到距底部1 cm處，電泳結(jié)束后剝下膠片，染色3～10 h，脫色至條帶清晰為止，照相并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)[18]。

1.4統(tǒng)計(jì)分析 根據(jù)SDS-PAGE電泳的特點(diǎn)，蛋白質(zhì)的電泳遷移率主要取決于它的分子量，而與所帶電荷和形狀無關(guān)，單體電泳遷移率與蛋白單體分子量的關(guān)系為：

lgMW=K1-bm

式中，MW為蛋白單體分子量，m為蛋白單體遷移率，K1和b為常數(shù)。

蛋白質(zhì)相對(duì)遷移率(Rf)=

通過已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白(Protein Marker)在相同電泳條件下的遷移率，繪制出分子量與遷移率的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計(jì)算供試材料的蛋白單體遷移率和分子量。對(duì)清晰蛋白質(zhì)條帶的有無進(jìn)行標(biāo)記，有為1，無為0，得出(0，1)矩陣。利用Popgene 1.31軟件進(jìn)行Nei’s遺傳距離(D)和遺傳一致度(I)分析。利用NTSYS-pc 2.1系統(tǒng)進(jìn)行聚類分析[19]。通過SAS軟件對(duì)不同提取液做差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

利用SDS-PAGE電泳技術(shù)對(duì)3個(gè)不同類型的尖葉胡枝子種子貯藏蛋白進(jìn)行電泳，獲得清晰穩(wěn)定的遺傳蛋白圖譜(圖1)。

圖1 3個(gè)不同類型尖葉胡枝子的蛋白電泳圖譜Fig.1 Electrophoregrams of seed storage proteins of three Lespedeza hedysaroides

2.1清蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白電泳結(jié)果 經(jīng)電泳染色、脫色后，點(diǎn)樣孔加入清蛋白和谷蛋白的泳道無清晰譜帶出現(xiàn)，點(diǎn)樣孔加入醇溶蛋白的泳道中出現(xiàn)幾條痕跡很淺的條帶。

2.2鹽溶蛋白譜帶遺傳多樣性分析 3份供試材料的鹽溶蛋白質(zhì)譜帶存在差異，共檢測(cè)出19條蛋白譜帶，其中6條譜帶為穩(wěn)定表達(dá)譜帶，表達(dá)率為100%；其余13條為不同程度表達(dá)的多態(tài)性譜帶，多態(tài)性數(shù)目占總條帶的68.42%。把整個(gè)蛋白譜帶劃分為4個(gè)區(qū)域：α區(qū)、β區(qū)、γ區(qū)和ω區(qū)，其中α區(qū)相對(duì)遷移率為0.7～1.0，β區(qū)相對(duì)遷移率為0.3～0.7，γ區(qū)相對(duì)遷移率為0.1～0.3，ω區(qū)相對(duì)遷移率為0～0.1。鹽溶蛋白的各區(qū)域均有條帶出現(xiàn)，其中α區(qū)有4條，β區(qū)有6條,γ區(qū)有6條，ω區(qū)有3條，分子量大小13.57～154.53 KDa(表1)。

計(jì)算3個(gè)不同類型尖葉胡枝子鹽溶蛋白的Nei’s的遺傳距離和遺傳一致度(表2)，普通型與濃綠型的遺傳距離最小,為0.021 3;普通型與高桿型的遺傳距離最大，為1.035 5。高桿型與普通型的遺傳一致度最小，為0.355 1，濃綠型與普通型的遺傳一致度最大，為0.978 9。

表1 3個(gè)不同類型尖葉胡枝子鹽溶蛋白電泳出現(xiàn)頻率和蛋白分子量Table 1 Frequency of bands and molecular weight of salt-soluble protein of three L. hedysaroides

表2 鹽溶蛋白 Nei’s遺傳一致度(右上角)和遺傳距離(左下角)Table 2 Nei’s of genetic identity (upper right corner) and genetic distance (lower left corner) of salt-soluble protein

根據(jù)3份供試材料的遺傳距離和遺傳一致度信息聚類得到聚類圖(圖2)。1(普通型)與2(濃綠型)之間距離系數(shù)為0.00，聚為一類；1、2與3(高桿型)的距離系數(shù)為0.56，3單獨(dú)聚為一類。

圖2 3個(gè)不同類型尖葉胡枝子的鹽溶蛋白聚類圖Fig.2 Dendrogram based on Nei’s genetic distance of salt-soluble proteins

2.3貯藏蛋白譜帶遺傳多樣性分析 3份供試材料之間的貯藏蛋白質(zhì)譜帶存在差異，共檢測(cè)到28條蛋白譜帶，其中19條譜帶為穩(wěn)定表達(dá)譜帶，表達(dá)率為100%；剩余9條為不同程度表達(dá)的多態(tài)性譜帶，多態(tài)率32.14%。α區(qū)有5條，β區(qū)有16條，γ區(qū)有7條，ω區(qū)無譜帶出現(xiàn)，分子量大小12.43～107.78 KDa。

表3 3個(gè)不同類型尖葉胡枝子貯藏蛋白電泳出現(xiàn)頻率和蛋白分子量Table 3 Frequency of bands and molecular weinght of storage protein of three L.hedysaroides

計(jì)算3個(gè)不同類型尖葉胡枝子貯藏蛋白的Nei’s遺傳距離和遺傳一致度(表4)，普通型與濃綠型的遺傳距離最小,為0.025 1；普通型與高桿型的遺傳距離最大,為0.238 2。高桿型與普通型的遺傳一致度最小,為0.788 0；濃綠型與普通型的遺傳一致度最大,為0.975 2。

表4 貯藏蛋白 Nei’s遺傳一致度(右上角)和遺傳距離(左下角)Table 4 Nei’s of genetic identity (upper right corner) and genetic distance (lower left corner) of seed storage protein

根據(jù)3份供試材料的貯藏蛋白聚類結(jié)果可知(圖3)，1(普通型)與2(濃綠型)之間距離系數(shù)為0.02，聚為一類；1、2與3(高桿型)的距離系數(shù)為0.10，3單獨(dú)聚為一類。

圖3 3個(gè)不同類型尖葉胡枝子的貯藏蛋白聚類圖Fig.3 Dendrogram based on Nei’s genetic distance of seed storage protein

2.4不同提取液的遺傳系數(shù)方差分析 對(duì)鹽溶蛋白和貯藏蛋白提取液的遺傳距離和遺傳一致度進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示兩種提取液的遺傳系數(shù)之間沒有顯著差異(P>0.05)。

3 討論與結(jié)論

蛋白質(zhì)作為基因表達(dá)的直接穩(wěn)定產(chǎn)物，能在生化水平上反映DNA組成上的差異，種子貯藏蛋白在種子細(xì)胞內(nèi)的積累、含量高低及組分的變化受相關(guān)基因的嚴(yán)格調(diào)控[20]。因此，種子貯藏蛋白被廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源的研究中，包括新品種登記和保護(hù)、品種親緣關(guān)系和分類研究以及構(gòu)建蛋白質(zhì)指紋圖譜等方面[21-22]。趙楊等[16]通過對(duì)二色胡枝子(L.bicolor)種子貯藏蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，14個(gè)居群貯藏蛋白電泳總譜帶數(shù)為28條，總多態(tài)帶為23條，多態(tài)帶率82.14%，胡枝子總遺傳多樣性指數(shù)為0.255，居群內(nèi)平均遺傳多樣性指數(shù)為0.136，占總遺傳多樣性指數(shù)的53.33%，說明居群內(nèi)變異是胡枝子基因結(jié)構(gòu)變異的主要來源。此外，各居群間也存在較高的遺傳分化。閆偉紅等[18]通過對(duì)40個(gè)野生居群的胡枝子屬植物種貯蛋白研究表明，供試材料的種貯蛋白譜帶的多態(tài)性達(dá)90.6%，這說明胡枝子屬植物無論在種間還是種內(nèi)都具有豐富的蛋白質(zhì)多態(tài)性。通過對(duì)胡枝子屬的蛋白質(zhì)電泳研究可以發(fā)現(xiàn)，遺傳變異大多來自胡枝子屬種內(nèi)或居群間，推斷導(dǎo)致遺傳變異的可能原因是長(zhǎng)期生物進(jìn)化而積累的遺傳物質(zhì)的變異以及由于優(yōu)勝劣汰而逐漸適應(yīng)生境的不同生態(tài)型之間的差異。

對(duì)3個(gè)不同類型尖葉胡枝子的蛋白電泳譜帶位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，不同提取液所獲得的蛋白譜帶各不相同。其中使用去離子水和0.2%NaOH溶液提取的尖葉胡枝子種子清蛋白和谷蛋白幾乎沒有或者含量甚微，使用75%乙醇溶液提取的尖葉胡枝子種子醇溶蛋白含量較少，在此不做詳細(xì)討論。利用鹽溶蛋白和貯藏蛋白提取液所得的總蛋白譜帶的分子量介于12.43～154.53 KDa，相對(duì)遷移率0.05～0.94。從電泳結(jié)果可以看出，鹽溶蛋白的γ區(qū)域是譜帶顏色、寬窄和多態(tài)性位點(diǎn)差異最明顯的區(qū)域；β區(qū)是貯藏蛋白均勻表達(dá)穩(wěn)定且集中的區(qū)域，γ區(qū)是譜帶多態(tài)性位點(diǎn)出現(xiàn)差異的區(qū)域[23-24]。鹽溶蛋白的蛋白譜帶總數(shù)為19條，多態(tài)率為68.42%,貯藏蛋白的為28條，多態(tài)率為32.14%，說明3份材料的鹽溶蛋白的條帶位點(diǎn)少于貯藏蛋白而種內(nèi)變異大于貯藏蛋白。聚類結(jié)果表明，利用鹽溶蛋白和貯藏蛋白獲得的蛋白質(zhì)圖譜能很好地區(qū)分鑒別3個(gè)不同類型的尖葉胡枝子，通過對(duì)鹽溶蛋白和貯藏蛋白的遺傳一致度進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示兩者之間沒有顯著差異。供試材料分為兩類:一類為普通型和濃綠型尖葉胡枝子；另一類為高桿型尖葉胡枝子，這從生化水平上證明高桿型尖葉胡枝子是尖葉胡枝子的種內(nèi)變異種。鹽溶蛋白是豆科植物種子中主要的貯藏蛋白質(zhì)[25]，且譜帶的多態(tài)性和分辨率較高，建議使用鹽溶蛋白對(duì)胡枝子屬植物的種內(nèi)(居群內(nèi))變異進(jìn)行遺傳多樣性進(jìn)行研究，效果更好。

[1] Pirie N W.Leaf Protein and Its By-product in Human and Ani-mal Nutrition[M].Cambridge:Cambridge University Press,1987:125-138.

[2] 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志:第四十一卷[M].北京:科學(xué)技術(shù)出版社,1995:131-158.

[3] 孫啟忠,韓建國(guó),桂榮,等.科爾沁沙地達(dá)烏里胡枝子生物量研究[J].中國(guó)草地，2001,21(4):21-26.

[4] 內(nèi)蒙古植物志編委委員會(huì).內(nèi)蒙古植物志[M].呼和浩特：內(nèi)蒙古人民出版社,1989:347-358.

[5] 馬彥軍,曹致中,李毅.胡枝子屬植物研究進(jìn)展[J].草業(yè)科學(xué),2010,27(10):128-134.

[6] 韓寶達(dá),李立新.植物種子貯藏蛋白質(zhì)及其細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)與加工[J].植物學(xué)報(bào)，2010,45(4):492-505.

[7] Fuji K，Shimada T，Takahashi H，etal.Arabidopsisvacuolar sorting mutants (green fluorescent seed) can be identified efficiently by secretion of vacuole-targeted green fluorescent protein in their seeds[J].Plant Cell,2007,19:597-609.

[8] Duranti M,Consonni A,Magni C,etal.The major proteins of lupin seed:characterization and molecular properties for use as functional and nutraceutical ingredients[J].Trends in Food Science & Technology，2008,19:624-633.

[9] 蘭海燕，李立會(huì).蛋白質(zhì)凝膠電泳技術(shù)在作物品種鑒定中的應(yīng)用[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002,35(8):916-920.

[10] 夏蘭琴,蔣尤泉,閻福林.扁蓿豆遺傳多樣性的研究[J].中國(guó)草地,1997(2):30-35.

[11] 郭江波,趙來喜.中國(guó)苜蓿育成品種遺傳多樣性及親緣關(guān)系研究[J].中國(guó)草地，2004,26(1):9-14.

[12] Webfr K,Osborn M.Proteins and sodium dodecyl sulfate,molecular weight determination on polyacrylamide gels and related procedures[A].The Proteins[M].NewYork:Academic Press,1975:180-206.

[13] 李擁軍,蘇加楷.中國(guó)苜蓿地方品種親緣關(guān)系的研究[J].草業(yè)學(xué)報(bào)，1999，8(1):31- 41.

[14] 黃秀麗,莊東紅,胡忠,等.南瓜屬4個(gè)栽培種種子蛋白質(zhì)電泳分析[J].武漢植物學(xué)研究2005,23(2):183-187.

[15] 汪家政，范明.蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社,2008：77-90.

[16] 趙楊,駢瑞琪,陳曉陽,等.二色胡枝子種子儲(chǔ)藏蛋白多樣性研究[J].西北植物學(xué)報(bào)，2007,27(9):1767-1771.

[17] 孫雁,朱有勇,朱永平,等.蛋白質(zhì)電泳在豌豆品種鑒定中的應(yīng)用[J].種子，2004，23(2):24-26.

[18] 閆偉紅,徐柱,師文貴,等.胡枝子屬植物40個(gè)野生居群種子蛋白譜帶多樣性研究[J].草業(yè)科學(xué)，2007,24(5):58-63.

[19] 劉曉云,戴燕燕,郭振國(guó),等.三葉草根瘤菌SDS-PAGE分析及結(jié)瘤試驗(yàn)分子驗(yàn)證[J].草業(yè)科學(xué)，2010,27(1):79-84.

[20] Kim W T，Okita T W.Expression of storage protein multigene families in developing rice endosperm[J].Plant cellphysiol，1993,34(4):374-378.

[21] Huaman Z．Stegemann H.Use of electrophoresis analyses to verify morphologically identical clones in a potato collection[J].Plant Varieties and Seeds，1989(2):155-161.

[22] 顏啟傳,鄧光聯(lián),支巨振.農(nóng)作物品種電泳鑒定手冊(cè)[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1998:1-8.

[23] 葛榮朝,趙寶存,李薇.利用鹽溶蛋白PAGE電泳法檢測(cè)玉米種子的研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2007,22(4):91-93.

[24] 王麗,張守華,陳新民.鹽溶蛋白電泳鑒定玉米種子純度的圖譜分析[J].種子科技,2003(5):191-192.

[25] 王文軍,景新明.種子蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)組的研究[J].植物學(xué)通報(bào)，2005，22(3):257-266.