常青山，張利霞，萬 濤，王慶亞，王 瑞

(1.河南科技大學(xué)林學(xué)院，河南 洛陽471003; 2.河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 洛陽 471003; 3.景德鎮(zhèn)高等專科學(xué)校生化系，江西 景德鎮(zhèn) 333000; 4.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210095；5.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095)

酸雨是當(dāng)今世界面臨的重大環(huán)境污染因素之一[1]。中國(guó)是目前世界上繼歐洲和北美之后出現(xiàn)的第三大酸雨覆蓋區(qū)域，境內(nèi)受污染的地區(qū)約占國(guó)土總面積的40%。酸雨成為目前中國(guó)面臨的極其嚴(yán)峻的環(huán)境污染問題之一[2-3]。酸雨能使人類賴以生存的生態(tài)環(huán)境發(fā)生重大改變，使土壤酸化、鹽基離子流失，導(dǎo)致作物根系發(fā)育嚴(yán)重受阻、活力顯著下降，并影響其對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收與利用，從而直接或間接地對(duì)作物的生長(zhǎng)及產(chǎn)量產(chǎn)生不良影響[2,4-5]。一般來說，植物種子在萌發(fā)與幼苗階段極易受到酸雨脅迫的不良影響[6-7]。因此，許多緩解酸雨脅迫的相關(guān)研究均在植物種子萌發(fā)與幼苗期展開[8-9]。大量研究表明，外源鈣處理可以降低細(xì)胞膜透性、穩(wěn)定細(xì)胞膜、提高抗氧化酶活性、減輕脅迫造成的氧化傷害[10-11]，可以緩解重金屬脅迫[12]、鹽脅迫[13-14]、酸雨脅迫等各種脅迫傷害[8]。

然而，外源鈣對(duì)不同脅迫緩解作用的研究多集中在農(nóng)作物[12,15]與經(jīng)濟(jì)作物上[16-17]，在草坪草中研究相對(duì)較少。隨著長(zhǎng)江中下游地區(qū)城市化進(jìn)程的加快，人們對(duì)城市園林綠化與生態(tài)環(huán)境的改善有了越來越高的追求，而酸雨卻成為影響城市綠化，特別是影響草坪綠化的一個(gè)重要因素[18]。因此，研究草坪草及其相關(guān)生態(tài)技術(shù)，有效緩解酸雨脅迫帶來的傷害，對(duì)酸雨地區(qū)城市生態(tài)環(huán)境保護(hù)與防治具有重要意義。高羊茅(Festucaarundinacea)作為一種綠期較長(zhǎng)的冷季型草坪草，廣泛用于城市園林綠化、運(yùn)動(dòng)場(chǎng)草坪的建植和公路護(hù)坡等生態(tài)建設(shè)工程中，在長(zhǎng)江中下游地區(qū)城市綠化中也有著大面積的應(yīng)用[19]。本研究以高羊茅種子為材料，研究不同濃度CaCl2溶液浸種對(duì)模擬酸雨脅迫下高羊茅種子萌發(fā)特性的影響，以期為長(zhǎng)江中下游酸雨地區(qū)高羊茅草坪建植提供理論與實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 高羊茅種子購(gòu)自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，從美國(guó)進(jìn)口，室內(nèi)袋裝貯藏，品種為金質(zhì)克拉多。

1.2模擬酸雨的配制 根據(jù)江蘇省實(shí)測(cè)降水中SO42-與NO3-的摩爾濃度之比 (約5∶1)[20]，參照曹春信等[21]的方法制備模擬酸雨：配制0.25 mol·L-1H2SO4和0.05 mol·L-1HNO3溶液，按等體積比配制模擬酸雨的酸母液；配制濃度高于天然酸雨成分1 000倍的電解質(zhì)母液，含3.1 g·L-1CaC12、8 g·L-1NH4Cl、0.91 g·L-1NaCl和0.75 g·L-1KCl。然后將電解質(zhì)母液稀釋1 000倍后，用酸母液調(diào)節(jié)模擬酸雨的pH值為2.5。

1.3方法 利用RXZ-300D人工智能氣候箱(寧波江南儀器制造廠)進(jìn)行種子發(fā)芽試驗(yàn)。培養(yǎng)條件：溫度(25±1) ℃，每天光照12 h，相對(duì)濕度80%。準(zhǔn)確稱取無水CaCl2，以去離子水配制成0(以無CaCl2的去離子水作對(duì)照)、5、10、25、50、100 mmol·L-1的 CaCl2溶液。選取籽粒飽滿、大小基本一致的高羊茅種子，用0.5%的雙氧水溶液消毒30 min，再經(jīng)去離子水漂洗3次并用吸水紙吸干表面水分，然后在上述配好的各種濃度CaCl2溶液及去離子水(對(duì)照)中浸泡24 h后，用去離子水漂洗種子3次，吸水紙吸干種子表面的水分。將浸種處理過的種子放入預(yù)先鋪上2層濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿50粒，4個(gè)重復(fù)，保持間距盡量一致。每個(gè)培養(yǎng)皿加入15 mL pH值2.5的模擬酸雨溶液進(jìn)行脅迫試驗(yàn)。每2 d換一次模擬酸雨溶液，每天打開2次，與外界換氣5 min，每24 h觀察記錄發(fā)芽情況；最后一天記錄最終發(fā)芽數(shù)及幼苗鮮質(zhì)量、苗高與根長(zhǎng)。本試驗(yàn)采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[22]規(guī)定的高羊茅末次計(jì)數(shù)時(shí)間(第14天)，從第1天開始每天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽的種子數(shù)，14 d后計(jì)算以下相關(guān)指標(biāo)[23-24]：

1)發(fā)芽率(GR)=(n/N)×100%(n為最終達(dá)到的正常發(fā)芽粒數(shù)，N為供試種子數(shù))；

2)發(fā)芽勢(shì)(GP)=(n5/N)×100%(n5為種子發(fā)芽第5天的正常發(fā)芽粒數(shù)，N為供試種子數(shù))；

3)發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑(Gt/Dt)(Gt為在t天的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù))；

4)活力指數(shù)=GI×S(GI為發(fā)芽指數(shù)，S為單株鮮質(zhì)量)；

5)鮮質(zhì)量、苗高和根長(zhǎng)：隨機(jī)抽取10株，計(jì)算高羊茅幼苗鮮質(zhì)量單株平均值，以及苗高與根長(zhǎng)單株平均值。

1.4質(zhì)膜透性測(cè)定與計(jì)算 測(cè)量發(fā)芽第14天的正常幼苗電導(dǎo)率，并以相對(duì)電導(dǎo)率來反映幼苗的膜透性[25]。參考韓永華等[26]的方法測(cè)定幼苗電導(dǎo)率：從對(duì)照及不同處理中分別稱取生長(zhǎng)一致的鮮苗0.1 g，剪成長(zhǎng)度為0.5 cm的小段，3個(gè)重復(fù)。用去離子水充分沖洗干凈后，用吸水紙吸干水分，置于20 mL試管中，并加10 mL去離子水，搖勻、密封，室溫放置24 h，用DDB-6200型數(shù)字電導(dǎo)儀測(cè)定電導(dǎo)率E1；然后置沸水浴中煮30 min，冷卻后測(cè)定電導(dǎo)率E2；同時(shí)測(cè)定其背景電導(dǎo)值E0。按下式計(jì)算電導(dǎo)率(P)：

P=(E1-E0)/(E2-E0)×100%.

1.5統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0進(jìn)行方差分析與多重比較(Duncan新復(fù)極差法)，然后采用Origin 8.0作圖。不同CaCl2處理對(duì)酸雨脅迫下高羊茅種子發(fā)芽的影響采用主成分分析與隸屬函數(shù)法進(jìn)行評(píng)價(jià)[27]。

隸屬函數(shù)值計(jì)算公式:

(1)

反隸屬函數(shù)值計(jì)算公式:

(2)

式中，Xj為第j個(gè)綜合指標(biāo)，Xmin、Xmax分別為第j個(gè)綜合指標(biāo)的最小值和最大值。若所測(cè)指標(biāo)與抗性指標(biāo)正相關(guān)則采用公式(1)，反之采用公式(2)。最后用各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值乘以相應(yīng)的權(quán)重系數(shù)(權(quán)重系數(shù)為負(fù)值時(shí)取絕對(duì)值)來計(jì)算綜合評(píng)定值。

2 結(jié)果與分析

2.1模擬酸雨脅迫下高羊茅種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì) 在模擬酸雨脅迫條件下，經(jīng)過CaCl2浸種的高羊茅種子的發(fā)芽率與發(fā)芽勢(shì)呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)(圖1A、圖1B)。各處理均高于對(duì)照，其中25～100 mmol·L-1CaCl2處理與對(duì)照差異顯著(P<0.05)。隨著CaCl2溶液濃度的升高，在50 mmol·L-1CaCl2溶液浸種處理下高羊茅發(fā)芽率與發(fā)芽勢(shì)達(dá)到最大，100 mmol·L-1CaCl2溶液處理開始下降，但仍高于對(duì)照。在25 mmol·L-1CaCl2溶液浸種下，高羊茅的發(fā)芽率與發(fā)芽勢(shì)分別比對(duì)照增加了12.41%和41.10%；在50 mmol·L-1CaCl2溶液浸種下，高羊茅的發(fā)芽率與發(fā)芽勢(shì)分別比對(duì)照增加了21.82%和58.40%。

2.2CaCl2溶液浸種對(duì)高羊茅種子發(fā)芽指數(shù)與活力指數(shù)的影響 不同濃度的CaCl2處理對(duì)模擬酸雨脅迫下的高羊茅種子的發(fā)芽指數(shù)與活力指數(shù)影響明顯，均高于對(duì)照；隨著CaCl2溶液濃度的升高，二者均呈先上升后下降的趨勢(shì)(圖1C、圖1D)。25和50 mmol·L-1CaCl2溶液處理下發(fā)芽指數(shù)顯著高于對(duì)照(P<0.05)，分別比對(duì)照增加了23.37%和31.98%。10～100 mmol·L-1CaCl2溶液處理下的高羊茅種子活力指數(shù)均顯著高于對(duì)照，其中25和50 mmol·L-1CaCl2溶液處理下的活力指數(shù)分別比對(duì)照提高了61.86%和76.10%。

圖1 CaCl2溶液浸種對(duì)模擬酸雨脅迫下高羊茅種子發(fā)芽率(A)、發(fā)芽勢(shì)(B)、發(fā)芽指數(shù)(C)和活力指數(shù)(D)的影響Fig.1 Effects of seed soaking in CaCl2 solution on germination rate (A), germination energy (B), germination index (C) and vigor index (D) of Festuca arundinacea seeds under simulated acid rain stress

2.3CaCl2溶液浸種對(duì)模擬酸雨脅迫下高羊茅幼苗生長(zhǎng)的影響 不同濃度下CaCl2溶液浸種處理對(duì)模擬酸雨脅迫下高羊茅種子幼苗苗高的影響明顯，均顯著高于對(duì)照(P<0.05)，25和50 mmol·L-1CaCl2處理幼苗苗高與對(duì)照相比分別增加了49.08%和56.35%，但二者差異不顯著(圖2A、圖2B)。從根長(zhǎng)來看，除5 mmol·L-1外，其他CaCl2濃度處理下的根長(zhǎng)均顯著高于對(duì)照，25和50 mmol·L-1CaCl2處理的根長(zhǎng)與對(duì)照相比分別增加了10.10和6.96倍。從增加的幅度來看，CaCl2浸種處理對(duì)根長(zhǎng)的影響高于對(duì)苗高的影響。

各處理下的幼苗鮮質(zhì)量均高于對(duì)照，除5 mmol·L-1CaCl2處理外，其他處理均與對(duì)照差異顯著(P<0.05)(圖2 C)。隨著處理濃度的增加，幼苗鮮質(zhì)量先增加，然后在100 mmol·L-1CaCl2處理下降低。25和50 mmol·L-1CaCl2處理可以顯著提高高羊茅種子在模擬酸雨脅迫下的鮮質(zhì)量，其鮮質(zhì)量分別比對(duì)照增加了34.82%和37.20%，但這兩個(gè)處理之間差異不顯著。

2.4不同濃度CaCl2浸種處理對(duì)模擬酸雨脅迫下高羊茅幼苗質(zhì)膜相對(duì)透性的影響 不同濃度CaCl2溶液處理下，高羊茅幼苗的電導(dǎo)率均顯著低于對(duì)照(P<0.05)(圖2D)。在5～25 mmol·L-1CaCl2濃度范圍，電導(dǎo)率隨CaCl2處理濃度升高而降低，在25 mmol·L-1CaCl2溶液處理下，其電導(dǎo)率達(dá)到最低值。在50和100 mmol·L-1CaCl2處理下，高羊茅幼苗的電導(dǎo)率隨CaCl2濃度增加而升高，幼苗的細(xì)胞膜透性增加。25和50 mmol·L-1CaCl2處理的電導(dǎo)率與對(duì)照相比分別減少44.36%與32.39%。

圖2 CaCl2溶液浸種對(duì)模擬酸雨脅迫下高羊茅幼苗苗高 (A)、根長(zhǎng) (B)、鮮質(zhì)量 (C)和電導(dǎo)率(D)的影響Fig.2 Effects of seed soaking in CaCl2 solution on seedling height (A), root length (B), fresh weight (C) and electrical conductivity (D) of Festuca arundinacea seedlings under simulated acid rain stress

2.5不同濃度CaCl2浸種處理對(duì)模擬酸雨脅迫下高羊茅種子萌發(fā)的綜合評(píng)定 主成分分析表明，第1主成分中，發(fā)芽率等發(fā)芽指標(biāo)對(duì)應(yīng)的相關(guān)系數(shù)分別為0.920、0.959、0.984、0.996、0.983、0.907、0.985和-0.913，特征根為7.319，累積貢獻(xiàn)率為91.49%。根據(jù)主成分的累積方差貢獻(xiàn)率大于80%～85%的原則[28]，選留第1主成分。發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、苗高在此成分上有較高載荷，說明鈣溶液浸種處理對(duì)模擬酸雨脅迫下的高羊茅這3個(gè)指標(biāo)的影響很大。提取這一主成分基本上可以反映全部指標(biāo)的信息，因此，應(yīng)用這一綜合變量來代替原來的8個(gè)變量。通過計(jì)算，獲得主成分表達(dá)式：

F1=0.340x1+0.354x2+0.364x3+0.368x4+0.363x5+0.335x6+0.364x7-0.337x8。

式中，x代表主成分表達(dá)式中的主成分變量,x1為發(fā)芽率，x2為發(fā)芽勢(shì)；x3為發(fā)芽指數(shù)，x4為活力指數(shù)，x5為苗高，x6為根長(zhǎng)，x7為鮮質(zhì)量，x8為電導(dǎo)率。

根據(jù)主成分表達(dá)式各指標(biāo)權(quán)重值的大小可以看出各指標(biāo)在鈣浸種對(duì)模擬酸雨脅迫下種子發(fā)芽特性影響大小的重要性，由大到小依次為發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、苗質(zhì)量、鮮質(zhì)量、發(fā)芽勢(shì)、根長(zhǎng)、發(fā)芽率、電導(dǎo)率。根據(jù)主成分表達(dá)式計(jì)算出各鈣溶液浸種處理的得分，5種濃度CaCl2溶液浸種處理影響耐酸雨脅迫的能力由強(qiáng)到弱依次為50、25、10、100、5、0 mmol·L-1(表1)。

表1 CaCl2浸種對(duì)模擬酸雨脅迫下高羊茅種子發(fā)芽特性的影響能力得分Table 1 The scores of effects of seed soaking in CaCl2 solution on germination characteristics of Festuca arundinacea seeds under simulated acid rain stress

為避免單一指標(biāo)的片面性并克服多個(gè)指標(biāo)的復(fù)雜性，全面而準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)CaCl2溶液浸種處理對(duì)高羊茅種子發(fā)芽特性及幼苗生長(zhǎng)狀況的影響，本研究采用隸屬函數(shù)法對(duì)不同濃度CaCl2溶液浸種處理對(duì)模擬酸雨脅迫的影響進(jìn)行評(píng)定，確定不同CaCl2溶液浸種處理對(duì)模擬酸雨脅迫的影響大小。依據(jù)各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，結(jié)合主成分分析中各指標(biāo)的權(quán)重值進(jìn)行綜合評(píng)定，綜合評(píng)定值越大，表明鈣溶液浸種對(duì)高羊茅在模擬酸雨脅迫下發(fā)芽能力的提高作用愈明顯。由表2可知，5種鈣溶液浸種處理對(duì)酸雨脅迫下高羊茅種子發(fā)芽能力的影響由強(qiáng)到弱的順序依次為50、25、10、100、5、0 mmol·L-1。兩種方法分析結(jié)果的一致性說明了本研究結(jié)果科學(xué)可靠。

表2 CaCl2浸種對(duì)模擬酸雨脅迫下的高羊茅發(fā)芽各指標(biāo)影響的隸屬函數(shù)分析Table 2 Subordinate function analysis of effects of seed soaking in CaCl2 solution on indices of seeds germination of Festuca arundinacea under simulated acid rain stress

3 討論

3.1鈣溶液浸種處理可以提高對(duì)模擬酸雨脅迫下的高羊茅種子發(fā)芽的數(shù)量與品質(zhì) 鈣是植物的必需元素之一，在細(xì)胞伸長(zhǎng)、分裂以及細(xì)胞膜構(gòu)成、滲透性等方面具有重要作用，已有大量研究證明其可以有效提高種子的活力[10,17,29]。與對(duì)照相比，適宜的鈣溶液浸種不僅顯著提高種子的發(fā)芽勢(shì)、活力指數(shù)及幼苗的苗高、根長(zhǎng)、鮮質(zhì)量，而且降低了幼苗的電導(dǎo)率，說明鈣溶液浸種在提高種子發(fā)芽率的同時(shí)，種子的品質(zhì)與活力也得以大幅度提高，這與前人的相關(guān)研究結(jié)果一致[8,30]。鈣溶液浸種可以提高模擬酸雨脅迫下高羊茅種子的發(fā)芽能力，一方面在于鈣溶液可以緩解模擬酸雨本身的酸度[31]，另一方面在于鈣可以激活H+-ATP酶增強(qiáng)植物對(duì)細(xì)胞質(zhì)pH值的調(diào)節(jié)，同時(shí)激活部分保護(hù)酶活性，從而減輕模擬酸雨脅迫對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞，增強(qiáng)細(xì)胞抗酸脅迫的能力[16,32-34]。

3.2鈣溶液浸種處理對(duì)模擬酸雨脅迫下高羊茅種子的發(fā)芽特性相關(guān)指標(biāo)的影響作用不同 鈣處理對(duì)模擬酸雨脅迫下高羊茅發(fā)芽的各指標(biāo)中的幼苗根長(zhǎng)影響作用最大，50 mmol·L-1CaCl2溶液浸種處理的根長(zhǎng)是對(duì)照的7.96倍，其次為活力指數(shù)，50 mmol·L-1CaCl2溶液浸種處理的活力指數(shù)比對(duì)照提高76.10%，該處理下的發(fā)芽勢(shì)與苗高分別比對(duì)照提高58.40%和56.35%，僅對(duì)發(fā)芽率的影響在各指標(biāo)中最小，比對(duì)照提高21.82%。模擬酸雨脅迫顯著抑制草坪草根系的生長(zhǎng)，對(duì)根長(zhǎng)的影響要顯著大于對(duì)幼苗苗高的影響[35]，而鈣溶液浸種處理則可顯著減少模擬酸雨脅迫對(duì)幼苗苗高與根長(zhǎng)的影響，對(duì)根長(zhǎng)的影響作用顯著大于對(duì)幼苗苗高的影響作用。原因可能在于隨著鈣對(duì)模擬酸雨脅迫的緩解，幼苗胚根所受脅迫減輕，高羊茅種子的胚根生長(zhǎng)速度快于胚芽，因而鈣處理表現(xiàn)對(duì)高羊茅根長(zhǎng)的影響較大。在鈣處理對(duì)鹽脅迫下的高羊茅種子萌發(fā)影響的研究中，高濃度鈣處理對(duì)高羊茅種子萌發(fā)產(chǎn)生傷害，其處理效果甚至低于對(duì)照[30]。而在本研究中，高濃度處理雖然效果較差，但仍高于對(duì)照，原因可能在于鈣處理對(duì)酸雨脅迫的緩解效果好于對(duì)鹽脅迫的緩解效果。

3.3模擬酸雨脅迫下高羊茅種子發(fā)芽隨鈣處理濃度增大具有先促進(jìn)后抑制的特點(diǎn) 鈣能參與膜結(jié)構(gòu)的保持與修復(fù)，穩(wěn)定膜脂及膜蛋白的結(jié)構(gòu)，維持植物細(xì)胞內(nèi)離子的平衡，保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的完整，使植物維持正常的生理活動(dòng)[15,17]。添加適量的鈣，可以維持鈣信號(hào)系統(tǒng)的正常發(fā)生與傳遞，加強(qiáng)質(zhì)膜的穩(wěn)定性，并進(jìn)一步維持細(xì)胞內(nèi)離子的平衡。從本研究結(jié)果也可以看出，適宜濃度的鈣溶液浸種有效降低幼苗的電導(dǎo)率，減少植物體內(nèi)細(xì)胞膜的損傷。而在50和100 mmol·L-1CaCl2處理下電導(dǎo)率則開始升高，相對(duì)增加了膜透性，原因可能在于較高濃度的鈣處理可能超過植物的吸收能力使植物造成滲透脅迫，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的離子平衡被打破，形成類似鹽害的破壞作用從而增加膜透性[30]。

綜合分析認(rèn)為，鈣溶液浸種可有效提高模擬酸雨脅迫下高羊茅種子的發(fā)芽能力，隨著CaCl2處理濃度的增加，高羊茅在模擬酸雨脅迫下種子發(fā)芽能力逐漸提高，但超過一定濃度后反而使高羊茅種子的發(fā)芽能力降低。其中以50 mmol·L-1CaCl2處理對(duì)模擬酸雨脅迫下的高羊茅種子發(fā)芽作用最好，本研究對(duì)于長(zhǎng)江中下游酸雨地區(qū)高羊茅草坪建植具有一定的指導(dǎo)意義，至于應(yīng)用于其他草坪草種是否有明顯的緩解效果則有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

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