劉 莉，包滿珠

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院 園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)楚天學(xué)院，湖北 武漢430205）

日本結(jié)縷草（Zoysiajaponica）又稱為結(jié)縷草，禾本科虎尾草亞科結(jié)縷草屬，自然分布于亞洲東部環(huán)日本海、渤海、黃海及東海沿岸，廣泛分布于我國東部、朝鮮半島和日本列島溫暖地帶［1］。結(jié)縷草低矮、堅(jiān)韌耐磨、耐踐踏、彈性好，具有發(fā)達(dá)的地下根莖，耐粗放管理，在園林、庭園和固土方面都有廣泛運(yùn)用，是草坪植物中適應(yīng)性強(qiáng)的一個(gè)暖季型草種［2］。

我國結(jié)縷草種質(zhì)資源極為豐富，位居世界各國之首［1，3-5］。但結(jié)縷草的應(yīng)用處于較低水平，如掠青采種，品種單一，尤其自主產(chǎn)權(quán)新品種匱乏。因此，資源創(chuàng)新是利用結(jié)縷草資源的當(dāng)務(wù)之急。傳統(tǒng)育種效率低下，具有較多困難，如有性雜交、花期不遇、小穗上的小花太小不便操作等［6］。因而，借助新型的分子生物學(xué)育種手段可有效地加快育種的步伐。

體細(xì)胞變異以其變異廣泛、遺傳復(fù)雜、可以保持品種的基本特性而成為獲得較多新種質(zhì)的一個(gè)捷徑，是新品種選育和生理研究的一種重要方法。狗牙根（Cynodondactylon）、結(jié)縷草和假儉草（Eremochloaophiuroides）通過體細(xì)胞變異育種已經(jīng)獲得一些新品系［7-13］。日本結(jié)縷草的組織培養(yǎng)研究已經(jīng)比較成熟，而且由種子誘導(dǎo)的愈傷可以長期繼代并獲得了較高的再生頻率［14-15］。結(jié)縷草自然分布區(qū)生態(tài)環(huán)境差異很大，是一種能適應(yīng)多種生境的廣生態(tài)幅植物［1］，利用分子標(biāo)記檢測(cè)同樣發(fā)現(xiàn)變異較大［16］，具有容易發(fā)生遺傳變異的特性。因此，組織培養(yǎng)是獲得體細(xì)胞變異的一種良好方法。

變異的方向及遺傳穩(wěn)定性是變異能否可利用的關(guān)鍵。鑒定體細(xì)胞變異一個(gè)通用、便捷的方法是表型的變異結(jié)合分子標(biāo)記遺傳穩(wěn)定性的雙重鑒定方法。日本結(jié)縷草的分子標(biāo)記方法已經(jīng)發(fā)展很快，但由于ISSR標(biāo)記法有較好的穩(wěn)定性及簡便性而成為本研究的首選方法。本研究以1粒日本結(jié)縷草種子誘導(dǎo)的愈傷繼代18個(gè)月后的再生植株為材料，在大田經(jīng)過小區(qū)種植，利用ISSR標(biāo)記檢測(cè)再生單株的DNA序列多態(tài)性，以期探討結(jié)縷草愈傷長期繼代再生植株的變異特點(diǎn)，并運(yùn)用于育種及其他研究中。

1 材料與方法

1.1 材料 從青島海源草坪有限公司購買的日本結(jié)縷草種子，通過組織培養(yǎng)［17］，誘導(dǎo)愈傷，其中1粒種子誘導(dǎo)出愈傷，經(jīng)增殖擴(kuò)繁繼代18個(gè)月后再生得到植株，種植于花盆中。隨機(jī)選取20棵單株，種植于小區(qū)中，設(shè)定3個(gè)重復(fù)，每個(gè)小區(qū)0.5m×0.5m，統(tǒng)一管理，水肥一致。

1.2 方法

1.2.1 表型性狀觀測(cè) 草層高度：指自然高度，重復(fù)3次；葉片長度和寬度：隨機(jī)抽取直立莖的頂部向下第2片成熟葉片5片，測(cè)定其長度和寬度；匍匐莖葉片長度和寬度：隨機(jī)取5片匍匐莖頂端下第2、3節(jié)成熟葉片測(cè)定其長度和寬度；匍匐莖的長度和數(shù)量，匍匐莖在相同生長時(shí)間（一個(gè)生長季）的蔓延長度和數(shù)量；生殖枝高度：指從地表到總狀花穗基部的自然高度，重復(fù)5次；穗長度：指花序的基本長度，重復(fù)10次；綠色期：以播種的草坪為對(duì)照，50%葉片枯黃視為失去觀賞性［18］。

1.2.2 總DNA的提取 采用CTAB方法［19］，提取新鮮幼嫩葉片總DNA，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA純度和濃度后置于-20℃下備用。

1.2.3 ISSR標(biāo)記分析 ISSR體系和PCR程序經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，選擇重復(fù)性好的反應(yīng)體系和程序：1×Buffer，2.0mmol·L-1Mg2＋，0.2mmol·L-1dNTP，1Utaq（Fermentas，深圳晶美生物工程公司購買），模板DNA 10ng，0.5μmol·L-1引物，加入重蒸水到20μL。PCR程序：94℃預(yù)變性4min，然后5個(gè)循環(huán)，退火溫度從60℃梯度降溫至56℃，一個(gè)循環(huán)降1℃，即94℃30s，60℃45s循環(huán)到94℃30s，56℃45s，72℃90s，后退火溫度在55℃時(shí)進(jìn)行33個(gè)循環(huán)（個(gè)別30個(gè)循環(huán)）；最后72℃延伸10min，4℃保存［20］。反應(yīng)在BIO-RAD的PTC-100TMPCR儀上進(jìn)行。

從實(shí)驗(yàn)室已有的40條ISSR引物中篩選多態(tài)性好、重復(fù)性好的引物6條（表1）。

表1 文中ISSR引物信息Table 1 ISSR primers used in this study

1.3 數(shù)據(jù)處理方法 表型性狀于2005年生長季測(cè)定，表型性狀中數(shù)量性狀取測(cè)量平均值，并利用SPSS 13.0對(duì)20個(gè)樣品做主成分分析，并將這些數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后用NTSYS軟件計(jì)算遺傳距離，利用UPGMA進(jìn)行聚類分析。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后在凝膠上具有相同遷移率的位置上有DNA條帶的記為1，無DNA條帶的記為0。記錄的ISSR的表型數(shù)據(jù)矩陣?yán)肗TSYS軟件以Nei’s遺傳距離做UPGMA聚類分析，并將表型數(shù)據(jù)與ISSR表型數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 主成分分析各指標(biāo)之間的關(guān)系 通過主成分分析得到各主成分特征值的大小，前5個(gè)主成分累計(jì)所占的比例為88.40%，可以代表整體（表2）。特征向量分析顯示各主成分權(quán)重沒有占較大優(yōu)勢(shì)，前5個(gè)主成分權(quán)重比較平均。第1主成分與直立莖草層高度、直立莖葉片長度和直立莖葉片寬度具有較高相關(guān)性，代表直立莖的表型；第2主成分主要表型指標(biāo)依次是匍匐莖的總長度、生殖枝高度和匍匐莖數(shù)量，主要是匍匐莖的蔓延能力和生殖枝高度；第3主成分的主要指標(biāo)為穗長及匍匐莖葉片長寬度；第4主成分主要指標(biāo)是綠色期；第5主成分中匍匐莖葉片長度，穗長和直立莖草層高度為主要指標(biāo)（表3）。根據(jù)各表型在主成分分析中前5個(gè)主成分的權(quán)重，可以確定能代表變異的重要表型性狀：直立莖、匍匐莖的葉片寬度和長度，生殖枝的高度和穗長及綠色期。其中綠色期僅與生殖枝高度相關(guān)性相對(duì)較高，相關(guān)系數(shù)為0.34（表4），說明日本結(jié)縷草綠色期的表現(xiàn)與生殖器官和表型較營養(yǎng)器官的表型更大。

根據(jù)代表整體的前5個(gè)主成分的主要表型指標(biāo)以及各表型指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)，10個(gè)性狀中可剔除直立莖葉片長度和匍匐莖總長度這兩個(gè)分別與直立草層高度和直立莖葉片長度的相關(guān)性極高的指標(biāo)（表4）。將優(yōu)選出來的8個(gè)表型指標(biāo)的聚類分析與全部表型指標(biāo)的聚類分析進(jìn)行比較，將兩種聚類結(jié)果做相關(guān)性分析，得出相關(guān)系數(shù)為r＝0.94，P＝1.000 0，說明優(yōu)選出來的8個(gè)表型完全可以代表整體。

2.2 利用變異系數(shù)分析結(jié)縷草表型變異 依據(jù)表型數(shù)據(jù)計(jì)算變異系數(shù)，發(fā)現(xiàn)在這些表型性狀中最大的是匍匐莖的長度，為57.1%；較小的是匍匐莖葉片寬度，為6.9%（表5）?？梢?，在調(diào)查的這些性狀中，匍匐莖和綠色期的變異較大，葉片的長寬變異較小。

表2 表型主成分分析總方差分析Table 2 Total variance analysis of different phenotype principal component analysis

表3 各表型在各主成分的載荷系數(shù)Table 3 Load factor of each phenotype in each principal component

表4 各表型性狀相關(guān)系數(shù)矩陣Table 4 Correlation coefficient matrix of Zoysia japonica phenotypes

表5 表型指標(biāo)變異系數(shù)分析Table 5 Variation coefficients of phenotype data

表6日本結(jié)縷草ISSR引物擴(kuò)增條帶多樣性及特異性Table 6 Polymorphism and specificity of ISSR marker amplified Bands

2.3 利用ISSR分析日本結(jié)縷草體細(xì)胞變異ISSR檢測(cè)中，6條ISSR引物擴(kuò)增出73條帶，其中多樣性條帶比例為83.6%，有5條引物多樣性條帶比例超過80%，適合對(duì)日本結(jié)縷草進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)；單個(gè)樣品的特異帶比例為15.1%（表6）。引物ISSR1、NSSR1和NSSR17檢測(cè)出單個(gè)樣品具有的特異性條帶（表6）。由于所有樣品植株來源于同一個(gè)種子的愈傷，具有相同遺傳背景，這種特異帶的檢測(cè)具有較大的研究意義。

3 討論

3.1 結(jié)縷草體細(xì)胞變異的原因分析 植物體細(xì)胞無性系變異產(chǎn)生的影響因素有很多，這些因素有生理狀態(tài)、外植體類型、物種和基因型，再生發(fā)生方式，培養(yǎng)基中一些成分如植物生長調(diào)節(jié)劑和氮素含量以及繼代培養(yǎng)的時(shí)間。變異頻率因因素不同而異。一般來講，在長期繼代培養(yǎng)中，體細(xì)胞變異易發(fā)生［21-22］，且變異頻率相對(duì)較高。

經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)自然界內(nèi)的結(jié)縷草種內(nèi)變異現(xiàn)象十分明顯［1，16］。宣繼平等［23］通過ISSR 標(biāo)記對(duì)野生結(jié)縷草屬的遺傳多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示57.4%的遺傳變異存在于種內(nèi)。利用流式細(xì)胞儀對(duì)結(jié)縷草屬植物檢測(cè)2C核酸的含量，Brian等［24］發(fā)現(xiàn)結(jié)縷草屬植物有較小的基因組，因而在形態(tài)學(xué)、生長習(xí)性、生物與非生物脅迫的反應(yīng)上存在極端差異。這些發(fā)現(xiàn)都揭示結(jié)縷草變異是結(jié)縷草種的特性決定的。在日本結(jié)縷草種子誘導(dǎo)愈傷組織及愈傷長期繼代中都加入較高濃度的2，4-D，是促進(jìn)變異的另一個(gè)因素［25］。長期繼代培養(yǎng)使愈傷組織處于旺盛的生長狀態(tài)，細(xì)胞不停的分裂，核酸不停的復(fù)制。頻繁的有絲分裂讓錯(cuò)誤的頻率在短時(shí)間內(nèi)累計(jì)，是造成體細(xì)胞變異的又一個(gè)原因。

3.2 日本結(jié)縷草體細(xì)胞變異特征分析 本研究顯示，日本結(jié)縷草的體細(xì)胞變異中，匍匐莖的數(shù)量和長度、綠色期在體細(xì)胞變異中較大。綠色期和草坪草的擴(kuò)張能力是草坪草質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，單位時(shí)間內(nèi)能發(fā)展較多的匍匐莖數(shù)量和長度也意味著更強(qiáng)的覆蓋能力，減少雜草的入侵，對(duì)于生長速度偏慢和綠色期偏短的結(jié)縷草來說匍匐莖的數(shù)量和長度這一變異十分重要。變異分析結(jié)果預(yù)示，有可能通過體細(xì)胞變異篩選到綠色期長、匍匐莖發(fā)達(dá)的優(yōu)異變異單株。但是葉片寬度變異系數(shù)相對(duì)較小，說明通過體細(xì)胞變異來改變?nèi)~片寬度相對(duì)困難。

自然界中，結(jié)縷草的變異同樣非常豐富，具有廣泛的地域適應(yīng)性和豐富的生態(tài)型。中國結(jié)縷草居群形態(tài)變異的研究指出匍匐莖長度是居群表型差異的主要性狀之一［26］。宣繼平和劉建秀［27］對(duì)64份中國野生結(jié)縷草生長速度的研究表明，日本結(jié)縷草的種內(nèi)匍匐莖總長度變異最大，變異系數(shù)為85.4%。綠色期的研究報(bào)道相對(duì)較少。Yaneshita等［28］在構(gòu)建RFLP遺傳圖譜的基礎(chǔ)上，對(duì)冬季葉色數(shù)量性狀基因（Quantitative Trait Locus，QTL）定位，找到了4個(gè)與冬季葉色相關(guān)的基因位點(diǎn)，并顯示綠色期由主效基因控制，同時(shí)體細(xì)胞變異特點(diǎn)為點(diǎn)突變較多，因而這也可以解釋本研究中為何體細(xì)胞變異中綠色期變化較大。

體細(xì)胞變異與結(jié)縷草野生資源有相似之處。對(duì)日本結(jié)縷草體細(xì)胞變異和野生資源葉片性狀變異系數(shù)進(jìn)行比較，匍匐莖葉寬變異系數(shù)分別為6.9%和15.8%，匍匐莖葉長變異系數(shù)分別為13.4%和27.5%，體細(xì)胞變異系數(shù)低于野生資源的變異。這與體細(xì)胞變異本身的特點(diǎn)有關(guān)，在分子水平上表現(xiàn)為點(diǎn)突變較多，簡單的質(zhì)量性狀的變異相對(duì)可能多一些。體細(xì)胞變異的表型中，在綠色期和匍匐莖葉片長和寬表現(xiàn)出比自然條件下更大范圍的變異，因而具有較高的研究價(jià)值。

日本結(jié)縷草體細(xì)胞變異較大，通過目的性脅迫，誘導(dǎo)篩選優(yōu)質(zhì)抗逆性的草坪草植株，是培育育種中間材料或優(yōu)良品系的方法。在基因型相同的愈傷組織中遺傳背景相同的表型變異，是研究表型分子機(jī)理的優(yōu)良材料。同時(shí)，其他方式，如射線、化學(xué)誘變劑等增加變異的概率的方法，也可以獲得更多的供篩選和利用變異。Schwartz等［29］對(duì)不同性狀遺傳力做了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)縷草草坪性狀除了冬季冬眠和返青，其他性狀都具有較高的廣義遺傳力，性狀表現(xiàn)受環(huán)境影響較小，預(yù)示可將多種優(yōu)良變異的性狀合并在一起遺傳給F1代，這個(gè)研究結(jié)果使育種工作中獲得結(jié)縷草變異變得更有意義。

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