俞 靚，井趙斌，魏 琳，程積民

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，陜西 楊凌712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西 楊凌712100；3.中國科學(xué)院水利部水土保持研究，陜西 楊凌712100）

典型草原是溫帶內(nèi)陸半干旱氣候條件下形成的草地類型，針茅屬植物是構(gòu)成其草原植被的重要組分［1］。在嚴(yán)重的人為干擾和惡劣的氣候影響下，作為建群種或優(yōu)勢種的針茅屬植物大范圍衰退［2］，因此從物種保護(hù)角度對其遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究具有重要意義。目前，利用DNA分子標(biāo)記對針茅屬植物的遺傳多樣性研究已有一些報(bào)道。趙念席等［3-6］、張慶等［7］和宋濤等［8］采用 RAPD 標(biāo)記分別分析了內(nèi)蒙古地區(qū)大針茅（Stipagrandis）和克氏針茅（S.krylovii）的遺傳分化，短花針茅（S.breviflora）的遺傳多樣性以及內(nèi)蒙古中東部地區(qū)貝加爾針茅（S.baicalensis）的遺傳關(guān)系。但應(yīng)用其他DNA分子標(biāo)記對我國針茅屬植物遺傳多樣性的研究尚未見報(bào)道。

本氏針茅（S.bungeana）又名長芒草，是一種喜暖旱生叢生禾草，屬于禾本科針茅屬無毛芒組（Sect.Leiostipa Dum），是黃土高原典型草原的建群種和優(yōu)勢種植物，同時(shí)也是治理水土流失、改善生態(tài)環(huán)境的優(yōu)良草種，因其草質(zhì)柔軟、營養(yǎng)豐富、適口性較好，又是牲畜較喜食的天然飼草［9］。近年來，黃土高原地區(qū)水土流失日趨嚴(yán)重，生態(tài)環(huán)境惡化，使得大面積的本氏針茅種群已不多見，因此，迫切需要對本氏針茅天然草原進(jìn)行保護(hù)。

分子標(biāo)記被認(rèn)為是研究遺傳多樣性的最有效途徑，在各種DNA分子標(biāo)記技術(shù)中，ISSR（Inter Simple Sequence Repeat）分子標(biāo)記技術(shù)，因其不具有物種特異性的特點(diǎn)［10］，目前被廣泛用于遺傳信息缺乏的牧草資源的遺傳多樣性研究中［11-15］。本研究對寧南山區(qū)6個(gè)本氏針茅種群的遺傳多樣性進(jìn)行ISSR分析，旨在探討本氏針茅種群遺傳多樣性及遺傳變異產(chǎn)生的分子生態(tài)機(jī)理，以期為本氏針茅草原的合理利用和科學(xué)管理提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 2010年7月中旬在寧夏回族自治區(qū)寧南山區(qū)，選取6個(gè)本氏針茅自然種群（均為典型草原，其他生境狀況詳見表1。在各種群內(nèi)，隨機(jī)挑選20株植物，單株間距離不小于10m，每株剪取幼嫩、健康、無病斑葉片若干，編號裝袋，置冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，于-80℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 采樣點(diǎn)的生境特征Table 1 Collected locations and habitat characteristics

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及檢測 采用改良的CTAB法提取基因組DNA，經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)雙重檢測。將各樣品的基因組DNA工作液濃度用TE緩沖液稀釋至20ng·μL-1作為PCR模板，保存母液和工作液于-20℃冰箱中備用。

1.2.2 引物篩選 引物選用加拿大哥倫比亞大學(xué)（University of British Columbia Biotechnology，UBC）公布的96個(gè)ISSR引物，由北京奧科生物工程公司合成。選取4個(gè)田間性狀表現(xiàn)差異較大的種群，每個(gè)種群內(nèi)隨機(jī)選取一個(gè)單株，共計(jì)4個(gè)單株進(jìn)行引物篩選，最終選取15個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰、多態(tài)性高且重復(fù)性好的引物用于種群遺傳多樣性的分析，引物序列見表2［16］。

表2 本氏針茅ISSR分析的引物序列Table 2 Primer sequences used in ISSR analysis of Stipa bungeana

1.2.3 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物的檢測 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：DNA 20ng、Taq DNA酶1U、dNTPs 0.18 mmol·L-1、引物0.75mmol·L-1、Mg2＋1.87、10×Buffer（100mmol·L-1Tris-HCl，pH 值8.3；500mmol·L-1KCl），不足體積的用ddH2O補(bǔ)充至20μL［17］。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：第1階段，94℃預(yù)變性5min；第2階段共35個(gè)循環(huán)，首先94℃變性45s，然后退火45s（退火溫度因不同引物而定，表2），再者72℃延伸90s；第3階段，72℃延伸5 min；最后4℃保存［18］。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，用0.1%的AgNO3進(jìn)行銀染，并在NaOH溶液中顯色，凝膠用高分辨率數(shù)碼相機(jī)拍照保存。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與分析 用人工讀帶的方法，選擇清晰可辨的擴(kuò)增條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，模糊不清的條帶忽略不計(jì)。按同一遷移位置上擴(kuò)增產(chǎn)物的有無進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，擴(kuò)增產(chǎn)物在相同遷移位置有帶賦值為“1”，無帶賦值為“0”，建立原始二元性狀數(shù)據(jù)矩陣，通過軟件DCFA 1.1［19］形成數(shù)據(jù)分析的原始文件，再依據(jù)不同的研究目的選取不同的軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析［20］。

在假設(shè)種群內(nèi)基因頻率處于Hardy-Weinberg遺傳平衡的前提下，利用POPGENE 1.32［21］軟件計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)比率（PPB）、Nei’s基因多樣性（H）和Shannon信息指數(shù)（I）等遺傳多樣性指數(shù)，用于估算各種群間的遺傳多樣性，種群內(nèi)和種群間的遺傳分化系數(shù)（φst）用軟件 AMOVA 1.55［21］計(jì)算。

利用POPGENE 1.32軟件，根據(jù)各條帶的出現(xiàn)頻率計(jì)算各種群間的遺傳距離（D）和遺傳一致度（I），并用非加權(quán)配對算術(shù)平均法（UPGMA）對各種群間遺傳距離進(jìn)行聚類分析，經(jīng)POPGENE軟件1 000次重抽樣構(gòu)建聚類圖。

利用Pearson相關(guān)分析（SPSS 16.0）的方法計(jì)算各種群遺傳多樣性指數(shù)與生態(tài)因子間（海拔、經(jīng)度、緯度、年均溫和年降水量）的相關(guān)系數(shù)。

利用R語言對各種群間的遺傳距離矩陣（POPGENE軟件計(jì)算所得）與實(shí)際地理距離矩陣進(jìn)行Mantel檢驗(yàn)，以檢驗(yàn)遺傳距離與實(shí)際地理距離之間的相關(guān)性［22］。

2 結(jié)果

2.1 本氏針茅的遺傳多樣性 15條ISSR引物在6個(gè)本氏針茅種群的120個(gè)單株中共擴(kuò)增出244條清晰的條帶，擴(kuò)增的DNA片段大部分集中在100～2 000bp（圖1），其中多態(tài)性條帶239條，多態(tài)性位點(diǎn)比率（PPB）為97.95%，Nei’s基因多樣性（H）為0.254 4，Shannon信息指數(shù)（I）為0.396 6。在6個(gè)種群中，A2種群的遺傳多樣性最高（PPB＝68.44%，H＝0.213 2，I＝0.324 4），而 A6種群的遺傳多樣性最低（PPB＝41.39%，H＝0.111 7，I＝0.173 4）（表3）。

2.2 本氏針茅的群體遺傳結(jié)構(gòu) 本氏針茅種群的遺傳變異通過POPGENE軟件分析得出，其種群總遺傳多樣性Ht＝0.254 4，種群內(nèi)遺傳多樣性Hs＝0.157 9，種群間遺傳多樣性 Dst＝0.096 5（Dst＝Ht-Hs），基因分化系數(shù) Gst＝0.399 6。結(jié)果表明，種群間的遺傳變異較低于種群內(nèi)的遺傳變異，分別占總遺傳變異的39.96%和60.04%。

分子變異方差分析（AMOVA）結(jié)果表明（表4），種群間的變異方差分量為16.142 6，種群內(nèi)不同個(gè)體間的方差分量為22.346 1，遺傳分化系數(shù)φst＝0.419，表明本氏針茅種群的變異是由不同種群（遺傳變異為41.90%）和種群內(nèi)個(gè)體（遺傳變異為58.06%）共同提供，即種群間的變異和種群內(nèi)不同個(gè)體的變異共同構(gòu)成了群體的遺傳差異，貢獻(xiàn)都達(dá)到了極顯著（P＜0.001）。上述結(jié)果與POPGENE的分析結(jié)果基本一致，均表明本氏針茅的遺傳變異主要存在于種群內(nèi)，種群間的遺傳變異較小。

圖1 引物UBC834對部分本氏針茅材料的ISSR擴(kuò)增圖譜Fig.1 ISSR fingerprints of some Stipa bungeana amplified with Primer UBC834

表3 6個(gè)本氏針茅種群的遺傳多樣性指數(shù)Table 3 Genetic diversity indexes of six populations of Stipa bungeana

2.3 種群間遺傳關(guān)系及聚類分析 基于Nei氏遺傳一致度和遺傳距離可進(jìn)一步分析種群間的遺傳分化程度［23］。本氏針茅6個(gè)種群中（表5），A3與A4間遺傳一致度最高，為0.977 7，相應(yīng)的遺傳距離最小，為0.022 5；而A1與A6間遺傳一致度最低，為0.706 1，遺傳距離最遠(yuǎn)，為0.347 9，說明A3與A4種群間的關(guān)系最近，A1與A6種群間的關(guān)系最遠(yuǎn)。

利用UPGMA法建立的系統(tǒng)樹可以直接反映植物種內(nèi)、種間或居群間的關(guān)系［24］，因此對本氏針茅種群的Nei’s遺傳距離構(gòu)建遺傳關(guān)系聚類圖（圖2）。此聚類圖表明，6個(gè)自然種群聚成4支：A3和A4種群聚成一支；A5和A6種群聚成一支；A1和A2種群各聚成一支。

根據(jù)6個(gè)種群間的遺傳距離矩陣值和地理矩陣值的Mantel檢測結(jié)果（圖2），在1 000次置換中，各種群間的遺傳距離大小和地理距離遠(yuǎn)近均無顯著相關(guān)性（r＝-0.156 9，P＝0.733＞0.05），說明引起本氏針茅種群分化的主要原因不是地理距離的遠(yuǎn)近。

表4 本氏針茅種群的分子變異方差分析（AMOVA）Table 4 Analysis of molecular variance（AMOVA）of Stipa bungeana populations

表5 本氏針茅種群遺傳一致度和遺傳距離Table 5 Genetic similarity coefficient and genetic distance of Stipa bungeana

圖2 基于本氏針茅種群間Nei’s無偏差遺傳距離構(gòu)建的UPGMA聚類Fig.2 Dendrogram generated by UPGMA based on Nei’s unbiased genetic distances among Stipa bungeana populations

2.4 遺傳多樣性指數(shù)與生態(tài)因子之間相關(guān)性分析 對本氏針茅種群ISSR標(biāo)記的遺傳多樣性指數(shù)與其所在生境的生態(tài)因子進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，結(jié)果表明，ISSR標(biāo)記的遺傳多樣性指數(shù)與其所處生境的生態(tài)因子均未達(dá)到顯著相關(guān)水平（表6），表明本氏針茅生境環(huán)境因子對本氏針茅的遺傳多樣性變化沒有顯著影響。

3 討論

3.1 本氏針茅的遺傳多樣性 遺傳多樣性一般是指種內(nèi)遺傳多樣性，即遺傳特性的差異程度，用于評價(jià)某物種與其環(huán)境的相互作用方式及被改造和利用的潛力［23］。本研究利用ISSR分子標(biāo)記對寧南山區(qū)6個(gè)本氏針茅自然種群120個(gè)單株材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用3種遺傳多樣性參數(shù)（多態(tài)性位點(diǎn)比率、Nei’s基因多樣性和Shannon信息指數(shù)）對其遺傳變異進(jìn)行了分析。本氏針茅各種群的多態(tài)性位點(diǎn)比率在41.39%～68.44%，總多態(tài)性位點(diǎn)比率為97.95%。這可能是由于有些位點(diǎn)僅在個(gè)別群體中表現(xiàn)出多態(tài)或只在個(gè)別群體中可檢測到，這些位點(diǎn)在各群體中分布的不均衡，導(dǎo)致總多態(tài)性位點(diǎn)比率很高［25］。一般認(rèn)為，多態(tài)性位點(diǎn)比率在50%左右時(shí)，植物的遺傳多樣性是豐富的［26-28］。就多態(tài)性位點(diǎn)比率來看，本氏針茅種群具有較高的遺傳多樣性，但是，多態(tài)性位點(diǎn)比率簡單直觀，會受樣本大小和條帶總數(shù)的影響，且不能反映各條帶的頻率變化，對遺傳多樣性的評價(jià)只能是一個(gè)粗略的估計(jì)值［28］。因此，基于Hardy-Weinberg假設(shè)的Nei’s基因多樣性和基于條帶表型頻率Shannon信息指數(shù)能更準(zhǔn)確的評價(jià)種群遺傳多樣性［29］。本氏針茅種群Nei’s基因多樣性（H＝0.254 4）明顯高于單子葉植物的平均值（H＝0.190 0）［30］，這個(gè)結(jié)果也說明本氏針茅種群具有較高的遺傳多樣性。在野外調(diào)查和取樣的過程中發(fā)現(xiàn)，本氏針茅產(chǎn)生種子的能力并不低，但最后能萌發(fā)成實(shí)生苗的種子比例卻較小。朱桂林等［31］發(fā)現(xiàn)針茅屬植物的有性繁殖與水分因子密切相關(guān)，水分條件好，實(shí)生苗存活率高，有性繁殖能力強(qiáng)。在黃土高原惡劣的生境中，本氏針茅主要是以珠芽進(jìn)行營養(yǎng)繁殖的。趙慶芳等［32］研究發(fā)現(xiàn)，種群內(nèi)較高的遺傳多樣性可由補(bǔ)充較低比例的實(shí)生苗來維持。因此，寧南山區(qū)本氏針茅種群遺傳多樣性較高的主要原因可能與實(shí)生苗的不斷補(bǔ)充有關(guān)。

表6 本氏針茅種群遺傳多樣性指數(shù)與生態(tài)因子之間的Pearson相關(guān)性Table 6 Pearson correlation analyses for the relationships between genetic diversity indexes and ecological factors of Stipa bungeana

圖3 6個(gè)本氏針茅種群間遺傳距離與地理距離的相關(guān)關(guān)系Fig.3 The correlation between geneticdistance and geographic distance for six populations of Stipa bungeana

3.2 本氏針茅的遺傳分化 群體遺傳結(jié)構(gòu)是指一個(gè)物種或群體的遺傳變異在空間的非隨機(jī)分布式樣，即群體內(nèi)、群體間的分布式樣以及在時(shí)間上的變化，在很大程度上代表了其進(jìn)化潛力［33］。因此，確定物種群體的遺傳結(jié)構(gòu)，有利于了解其生物學(xué)特性、探討其進(jìn)化過程和機(jī)制。群體遺傳分化是衡量遺傳結(jié)構(gòu)的重要指標(biāo)，表示種群間的變異占總的遺傳變異中的比例［34］。利用分子方差變異AMOVA分析對本氏針茅種群的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，其遺傳分化系數(shù)達(dá)到0.419，明顯大于單子葉植物（Gst＝0.231）和多年生草本植物（Gst＝0.233）［35］，說明本氏針茅種群發(fā)生了較大程度的遺傳分化，其遺傳變異主要存在于種群內(nèi)，種群間的遺傳變異相對較小。

Hamarick和 Godt［35］報(bào)道，植物的繁育系統(tǒng)、種子擴(kuò)散機(jī)制、繁殖方式以及自然選擇等因素對其遺傳特征產(chǎn)生很大影響。作為典型的風(fēng)媒傳粉植物，本氏針茅的花粉和種子的傳播與擴(kuò)散無疑會影響其遺傳分化。本研究的野外調(diào)查和取樣生境為寧南山區(qū)，位于黃土高原半干旱區(qū)的典型草原，雖秋季多強(qiáng)風(fēng)，但地形復(fù)雜，致使種子和花粉遠(yuǎn)距離傳播受阻。另外，本氏針茅是牲畜所喜食的放牧型牧草，其春季萌發(fā)較早，在其他牧草尚未生長時(shí)就被牲畜大量采食，很難形成一個(gè)集中的高活力種子庫，且無法依靠牲畜攜帶進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播。因此，本氏針茅種群內(nèi)的遺傳變異大于種群間的遺傳變異的主要原因是種子無法遠(yuǎn)距離傳播。

在對風(fēng)媒植物的遺傳分化研究中，許多學(xué)者認(rèn)為［36-37］，當(dāng)種群間的遺傳距離與地理距離之間不存在顯著相關(guān)時(shí)，影響種群間遺傳分化的主要因素則是遺傳漂變或自然選擇，而不是遷移或基因流。本研究中Mantel檢驗(yàn)結(jié)果顯示，在6個(gè)本氏針茅種群中，任意種群間的遺傳距離和地理距離均沒有顯著的相關(guān)關(guān)系（P＝0.733）。Volis等［38］曾認(rèn)為，種群間的遺傳分化與氣候因子之間存在顯著相關(guān)關(guān)系的關(guān)鍵就在于種群間的遺傳分化是否因其遺傳漂變引起。本研究中，來源于不同地理類群的本氏針茅，其遺傳多樣性指數(shù)與其不同生境的若干氣候因子均未達(dá)到顯著相關(guān)關(guān)系。綜上所述，引起寧南山區(qū)本氏針茅種群間遺傳分化較大的原因可能是由種子與花粉傳播受阻以及遺傳漂變。

3.3 種群保護(hù)措施 在黃土高原半干旱區(qū)特殊的生境中，本氏針茅有性繁殖能力較弱，以珠芽的營養(yǎng)繁殖為主，因此，一方面要采取相應(yīng)的科學(xué)保護(hù)管理措施，加強(qiáng)對其原生境的保護(hù)，防止人為干擾，阻止種群遺傳多樣性的衰?。涣硪环矫嬉訌?qiáng)對本氏針茅種子繁殖系統(tǒng)的深入研究，提高其在自然生境中的萌發(fā)力，以保護(hù)野生種質(zhì)資源的可持續(xù)利用。

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