劉 芳，王曉麗，張彥妮，楊青杰，周蘊(yùn)薇

(1.東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；3.呼倫貝爾市蠶業(yè)科學(xué)研究所，內(nèi)蒙古 呼倫貝爾 162650)

百合(Liliumspp.)是世界著名的球根花卉，觀賞價(jià)值較高，培育高品質(zhì)的新品種百合來滿足日益增長的市場需求已迫在眉睫。而野生種百合則是品種選育的重要資源，野生種百合的微繁研究對(duì)于野生資源的馴化及新品種選育和遺傳性狀的改良等都極為重要[1-2]。垂花百合(L.cernum)在我國主要分布于吉林省長白山地區(qū)，在百合屬植物中屬珍稀耐寒野生種。利用組培再生的方法能夠保證原種的優(yōu)良特性和較高的繁殖系數(shù)[3]。目前，百合離體培養(yǎng)大部分以鱗片[4]作為外植體，也有以花絲[5]、花藥[6]、子房[7]、葉片[8]、胚等作為外植體取得成功的報(bào)道。垂花百合具有良好的觀賞性狀，同時(shí)也是具較強(qiáng)抗性的野生種，是百合抗性育種的重要親本。對(duì)垂花百合進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)及植株再生試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)中部或內(nèi)部鱗片基部再生頻率較高，再生植株葉片基部分化能力最強(qiáng)[9]；對(duì)其鱗莖進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)鱗莖誘導(dǎo)最適宜的培養(yǎng)基為N6+0.05 mg·L-1IAA+0.50 mg·L-1KT，鱗莖萌發(fā)為完整植株的最佳培養(yǎng)基為N6+0.01 mg·L-1IAA+0.001 mg·L-1NAA[10]。但鱗莖作為地下貯藏器官，極易攜帶病菌，表面消毒后仍會(huì)不同程度地帶菌，不利于種質(zhì)長期保存和規(guī)?；a(chǎn)；而花器官為幼嫩器官，污染小，同時(shí)研究花器官的離體培養(yǎng)也是對(duì)垂花百合生物學(xué)特性的有益補(bǔ)充。為此，本研究比較不同的激素配比條件下垂花百合花瓣、花托、子房愈傷組織的誘導(dǎo)和分化能力，篩選不同的愈傷組織誘導(dǎo)和分化效果最佳的培養(yǎng)基，以期為垂花百合的基因工程和細(xì)胞工程育種研究及百合產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供有益參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 選擇來源于長白山地區(qū)生長健壯、無病蟲害的垂花百合未開放的花作為外植體，進(jìn)行花器官離體培養(yǎng)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法 將垂花百合未開放的花蕾在洗衣粉水中漂洗10 min后，在流水下沖洗30 min，在超凈工作臺(tái)上用75%的無水乙醇消毒30 s，然后用2% NaClO消毒10 min，再用無菌水沖洗4～5次。用鑷子和刀將花蕾分成花瓣、花托、子房3部分，接種于添加不同濃度的6-芐基腺嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)MS培養(yǎng)基中。每處理30個(gè)外植體，重復(fù)3次。45 d時(shí)統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率，65 d時(shí)統(tǒng)計(jì)愈傷組織分化率。

誘導(dǎo)率=(誘導(dǎo)愈傷組織外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%；

分化率=(分化成苗外植體數(shù)/誘導(dǎo)愈傷組織外植體數(shù))×100%[11]。

將由花瓣誘導(dǎo)出的芽經(jīng)增殖培養(yǎng)后，切成單株接入添加不同生長激素的生根培養(yǎng)基中，生根培養(yǎng)基成分為1/2 MS+AC 0.5 g·L-1附加不同濃度的吲哚丁酸(IBA)及NAA。每處理30個(gè)外植體，各處理3次重復(fù)。30 d后統(tǒng)計(jì)生根情況。培養(yǎng)條件為(25±2) ℃，光強(qiáng)為3 000 lx，光周期為光培養(yǎng)14 h，暗培養(yǎng)10 h。

2 結(jié)果與分析

2.1不同激素配比條件下花瓣愈傷組織誘導(dǎo)及分化情況 不同培養(yǎng)基對(duì)花瓣愈傷組織的誘導(dǎo)效果存在顯著差異(表1)。在MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1激素組合的培養(yǎng)基上，愈傷組織誘導(dǎo)及分化效果最好，誘導(dǎo)率可達(dá)57.65%，分化率可達(dá)81.12%。當(dāng)NAA濃度升高，愈傷組織的誘導(dǎo)率及分化率相應(yīng)提高，在NAA 0.1 mg·L-1水平上，花瓣未見愈傷組織形成，說明低濃度NAA不利于誘導(dǎo)愈傷組織。隨著6-BA濃度的升高，愈傷組織分化成苗的分化率相應(yīng)升高，說明較高濃度的6-BA有利于愈傷組織進(jìn)行分化。

表1 不同激素配比條件下花瓣愈傷組織誘導(dǎo)及分化情況Table 1 Petals,ovary,and receptacle explants callus induction and differentiation of Lilium cernum under different hormone combinations

2.2不同激素配比條件下子房愈傷組織誘導(dǎo)及分化情況 在MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1激素組合的培養(yǎng)基上，子房愈傷組織誘導(dǎo)及分化效果最好，誘導(dǎo)率可達(dá)35.22%，分化率可達(dá)61.11%(表1)。并且隨NAA濃度的升高，愈傷組織的誘導(dǎo)率及分化率也相應(yīng)提高，高濃度NAA與低濃度NAA的培養(yǎng)基對(duì)子房誘導(dǎo)愈傷組織的效果存在顯著差異；隨著6-BA濃度升高，愈傷組織的誘導(dǎo)率先上升后下降。

2.3不同激素配比條件下花托愈傷組織誘導(dǎo)及分化情況 在MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1的激素組合的培養(yǎng)基上花托愈傷組織誘導(dǎo)及分化情況最好，誘導(dǎo)率可達(dá)36.67%，分化率可達(dá)44.34%。在NAA 0.2 mg·L-1與不同濃度的6-BA的培養(yǎng)基中，花托愈傷組織誘導(dǎo)效果差異明顯(表1)。當(dāng)NAA濃度增加時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率及分化率先增加后減少；隨著6-BA濃度的升高，愈傷組織的誘導(dǎo)率先上升后下降。由此可知，花托誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)，6-BA和NAA的濃度均不宜過高也不宜過低。

2.4百合花器官愈傷組織誘導(dǎo)及分化的比較

2.4.1不同花器官外植體愈傷組織誘導(dǎo)及分化的比較 垂花百合的花器官在離體培養(yǎng)過程中愈傷組織的誘導(dǎo)及分化的時(shí)間較長，外植體誘導(dǎo)愈傷組織由易到難依次為花瓣>花托>子房(圖1)。

花瓣的分化率明顯高于其他部位，且分化所需時(shí)間最短。接種3 d后花瓣顏色明顯變深呈粉色(圖1A)；20 d后部分花瓣切口處開始膨大，溝壑變明顯，花瓣顏色變淺，35 d后開始形成綠色愈傷組織，40 d開始形成不定芽(圖2B)；55 d后每個(gè)外植體上平均分化出芽4.8個(gè)，最多達(dá)14個(gè)(圖1C)。

子房的誘導(dǎo)率和分化率次之，且時(shí)間較花瓣長。接種2 d后子房明顯膨大，顏色變成黃綠色(圖1D)；40 d時(shí)繼續(xù)膨大，顏色變?yōu)榫G色，部分子房切口處產(chǎn)生帶有絨毛的白色根狀物(圖1E)；60 d后開始形成愈傷組織，65 d后開始形成不定芽(圖1F)。

花托的愈傷組織誘導(dǎo)和分化的能力介于花瓣和子房之間，所需時(shí)間較花瓣長，較子房短。接種3 d后，花托明顯膨大，表面變粗糙，顏色變?yōu)榈S綠色(圖1G)；45 d后開始形成愈傷組織，并且產(chǎn)生帶有絨毛的白色根狀物(圖1H)；60 d后白色根狀物也形成愈傷組織并產(chǎn)生不定芽(圖1I)。

2.4.2不同激素組合對(duì)花器官愈傷組織誘導(dǎo)及分化的比較 在百合組培苗誘導(dǎo)過程中，適量添加NAA對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及分化有明顯的促進(jìn)作用。6-BA能誘導(dǎo)不定芽的產(chǎn)生，使其大量增殖，如果6-BA濃度過高，同樣也會(huì)誘導(dǎo)部分外植體產(chǎn)生大量的不定根，從而抑制不定芽的形成，抽葉多，植株不能健壯生長和發(fā)育[12]。本研究中，花瓣、子房、花托3種外植體對(duì)低濃度的6-BA、NAA都不敏感，誘導(dǎo)花瓣愈傷組織及分化的培養(yǎng)基中6-BA、NAA濃度都很高，不同外植體誘導(dǎo)愈傷組織對(duì)激素配比濃度需求不同，誘導(dǎo)愈傷組織及分化效果也有差異。這種差異可能是由于百合品種及外植體的不同導(dǎo)致的。

2.5生根與移栽 將分成單株的小苗接于含有0.5 g·L-1活性炭，附加不同生長激素濃度的1/2 MS生根培養(yǎng)基中。結(jié)果表明，由花瓣誘導(dǎo)的小苗在1/2 MS+IBA 1.0 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1+AC 0.5 g·L-1的生根培養(yǎng)基中生根率最高達(dá)71.11%，平均根長達(dá)2.03 cm(表2)。隨著IBA濃度的增加，垂花百合的生根率也升高。在本研究中，活性炭的加入有利于垂花百合的生根，使根的長度增加，長勢變壯(圖1J)。將根長2～4 cm的小苗煉苗3 d，然后移栽至已滅菌的蛭石中，浸透水后放入人工氣候箱內(nèi)緩苗，15 d后移到溫室。移栽后的小苗生長良好，成活率可達(dá)80%(圖1K)。方差分析表明，不同濃度激素組合的培養(yǎng)基對(duì)百合生根率及根長的影響均有不同程度的差異。

3 討論

在百合的組織培養(yǎng)研究中，許多器官、組織都可以用作外植體，其中以鱗片作外植體的頻率最高，但鱗片取材對(duì)母本傷害大，且消毒處理難度大、易污染[4，10]，未授粉的花器官培養(yǎng)和人工授粉后的花器官培養(yǎng)對(duì)培育百合新品種和保持母本優(yōu)良特性有重大研究意義。

本研究對(duì)垂花百合花器官(花瓣、花絲、花藥、花柱、子房、花托、花梗)進(jìn)行了離體培養(yǎng)，其中花絲、花柱、花梗開始時(shí)膨大，形成愈傷組織，但后期大量褐化死亡，只有花絲在MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1培養(yǎng)基上有兩個(gè)分化不定芽，花藥在培養(yǎng)期間未能形成愈傷組織及分化，表明垂花百合誘導(dǎo)愈傷組織由易到難依次為花瓣>花托>子房，但亞洲百合‘米麗拉’花器官組織培養(yǎng)再生植株不同部位的分化率從高到低依次為花絲、花柱、子房、花托、花瓣、花藥[13]，這可能是由供試品種的差異性導(dǎo)致的。

圖1 垂花百合花器官外植體愈傷組織誘導(dǎo)及分化Fig.1 Floral organ explant callus induction and differentiation of Lilium cernum

表2 不同激素組合對(duì)垂花百合生根的影響Table 2 Effects of different hormone combinations on rooting of Lilium cernum

植物生長調(diào)節(jié)劑在組織培養(yǎng)中發(fā)揮著重要的作用，在含量極低時(shí)就可以影響植物細(xì)胞的分裂、分化，以及植物體的生長、發(fā)育、形態(tài)建成等許多生理生化過程。研究表明，NAA對(duì)外植體愈傷組織誘導(dǎo)與分化起到一定的作用，較低濃度的NAA不利于誘導(dǎo)愈傷組織。這一結(jié)果與劉麗敏等[14]在百合花器官的組織培養(yǎng)中的結(jié)果一致，適宜濃度的NAA有利于百合花器官的初代誘導(dǎo)。

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