楊 寧，陳錫蓮，高新彥，史萬斌，劉效瑞

(1.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070； 2.蘭州市城關(guān)區(qū)徐家山林場，甘肅 蘭州 730000；3.定西市旱作農(nóng)業(yè)科研推廣中心，甘肅 定西 743000)

我國對中藥材的研究已有幾千年的歷史,中藥材資源豐富，是世界中藥材的主產(chǎn)國。甘肅省中藥種植歷史悠久，是全國藥用黨參(Codonopsispilosula)種植的主產(chǎn)區(qū)。中藥材的品質(zhì)關(guān)系到臨床用藥的安全有效，發(fā)展道地藥材是實現(xiàn)中藥現(xiàn)代化的關(guān)鍵，也是占有市場、增強產(chǎn)品競爭力的基本保障。目前，產(chǎn)生道地藥材地域性現(xiàn)象的原因除了與栽培方法、生態(tài)環(huán)境、加工方法有關(guān)外，還與物種居群的遺傳特異性有關(guān)，這可能是造成道地藥材與非道地藥材品質(zhì)差異的原因。道地藥材與非道地藥材在形態(tài)和生藥性狀等特征上的差別并不顯著，應(yīng)用傳統(tǒng)方法鑒別道地藥材變得困難。因此，藥材道地性研究已經(jīng)成為中醫(yī)藥科研的重要課題[1-2]。

黨參為桔?？浦参铮h參及其同屬多種植物的干燥根可入藥，其性味甘平、無毒，有補中益氣、生津止渴等功效。主治脾胃虛弱、中氣不足、肺氣虧虛、熱病傷津、氣短口渴、血虛萎黃、頭暈心慌等癥， 是我國傳統(tǒng)的補益藥[3]。甘肅黨參產(chǎn)量居全國之首，主要生產(chǎn)于甘肅的武都、文縣、宕昌、岷縣、渭源、漳縣等地[4]。目前黨參生產(chǎn)中，普遍使用傳統(tǒng)栽培育種方法，品系親緣關(guān)系不明確，缺乏品系鑒定的分子依據(jù)，這已經(jīng)成為甘肅黨參產(chǎn)業(yè)發(fā)展的限制瓶頸之一。隨機擴增DNA多態(tài)性(Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)技術(shù)以其操作簡單、快速、花費少、DNA用量少、無放射性等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于中草藥種質(zhì)資源親緣關(guān)系鑒定、遺傳多樣性及藥材道地性研究等方面[5-8]。

本研究正是基于甘肅省黨參生產(chǎn)及實際銷售中不能提供科學(xué)的藥材道地性鑒定方法等問題，利用RAPD技術(shù)對甘肅省定西市旱作農(nóng)業(yè)科研推廣中心新選育黨參8個品系和2個主栽品種進行分析鑒定，考證其遺傳多樣性和親緣關(guān)系，以期為甘肅省黨參的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供部分分子生物學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗材料 本試驗所用10個黨參樣品由甘肅省定西市旱作農(nóng)業(yè)科研推廣中心提供，采集于2010年6月。摘取10個黨參樣品的幼葉，用硅膠干燥后帶回實驗室。供試樣品編號見表1。

1.2方法

1.2.1總DNA的提取 用SDS方法[9-10]提取植物基因組DNA。將足量黨參的葉片加液氮研磨，加提取液后水浴保溫，而后加入適量氯仿-異戊醇，離心后加無水乙醇使DNA析出。

1.2.2PCR擴增 反應(yīng)在BIO-RAD普通型PCR儀上進行，RAPD引物由北京奧科生物技術(shù)公司生產(chǎn)，所用Taq酶及dNTPs購自天根生化科技(北京)有限公司。

引物篩選參照張建清等[11]的方法，略作修改。RAPD反應(yīng)體系：100 ng·μL-1模板DNA 1 μL，10 μmol·L-1隨機引物2 μL，2.5 μmol·L-1dNTPs 1 μL，10×Buffer 2.5 μL，2.5 U·μL-1Taq酶 0.5 μL，加ddH2O至25 μL。

表1 供試材料編號、名稱和采集數(shù)Table 1 Number, name and collection quantity of the tested materials

擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min后，94 ℃ 1 min，34.5 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，共計43個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

采用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠(EB)染色，UVI凝膠圖像分析系統(tǒng)觀察照相。每個試驗至少重復(fù)3次。

1.2.3數(shù)據(jù)處理 參照Williams等[12]的方法，電泳擴增圖譜中的每一條帶(DNA片段)均為一個分子標(biāo)記(Marker)，且代表一個引物結(jié)合位點，所有位點的二元數(shù)據(jù)是通過統(tǒng)計標(biāo)記各分子在相同電泳遷移率下(相同分子量片段)的有無得到的，有DNA擴增帶(顯性)為1，無帶(隱性)記為0，強帶和弱帶賦值為1。由NTSYS-PC 統(tǒng)計分析軟件系統(tǒng)中的Dice得到材料間的相似系數(shù)矩陣，建立系統(tǒng)聚類分支樹狀圖。重復(fù)試驗中能穩(wěn)定出現(xiàn)的差異帶即多態(tài)性位點用于數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1RAPD多態(tài)性分析 通過篩選，從60條隨機引物中選擇譜帶清晰、重復(fù)性好、多態(tài)性較豐富的14條隨機引物用于PCR擴增反應(yīng)(表2)。14條引物共擴增出159個位點，其中多態(tài)性位點比率為46.43%，不同引物的擴增位點變幅為7～16個，平均每條引物能擴增出11.4個位點，圖1為3號和5號引物的擴增結(jié)果。

表2 引物序列和擴增結(jié)果Table 2 Primers and amplified results

圖1 引物P3(左圖)和P5(右圖)擴增的RAPD帶型Fig.1 RAPD results generated by P3 (left) and P5 (right) primers

2.2遺傳距離和聚類分析 用NTSYS-PS統(tǒng)計分析軟件中的Dice方法得到材料間的遺傳相似性系數(shù)和遺傳距離(表3)，供試材料間遺傳相似系數(shù)(GS)值的變化范圍為0.771 9～0.964 9，其平均值為0.834 2。相似系數(shù)越大，材料間的遺傳距離越?。幌嗨葡禂?shù)越小，反之親緣關(guān)系越遠。本研究所采用黨參資源為甘肅省定西市旱作農(nóng)業(yè)科研推廣中心選育的8個新品系和2個主栽品種，即RAPD標(biāo)記的是種間多態(tài)性，相似系數(shù)值變化范圍較小，此結(jié)論與盛麗等[13]在當(dāng)歸種質(zhì)資源RAPD分析中獲得的結(jié)果相似。

根據(jù)RAPD數(shù)據(jù)得到的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離圖，按UPGMA法進行聚類分析，建立聚類分支樹狀圖(圖2)。DS6品系與所有其他供試材料的親緣關(guān)系最遠，可單獨聚為一類；DS3品系與DS8品種的親緣關(guān)系最近，其相似系數(shù)為0.964 9。其他黨參材料間的遺傳相似系數(shù)變化不大，表明黨參的種間遺傳關(guān)系較近。

表3 10個黨參品種(品系)間的遺傳相似性系數(shù)和遺傳距離Table 3 Genetic similarity coefficient and genetic distance among 10 Codonopsis pilosula varieties (strains)

圖2 10個黨參品種(品系)的UPGMA聚類圖Fig.2 UPGMA cluster analysis of 10 Codonopsis pilosula varieties (strains)

3 討論與小結(jié)

3.1RAPD-PCR體系的建立 影響PCR擴增條帶的因素有模板DNA、引物、dNTPs量、Taq酶、退火溫度、電泳中的瓊脂糖質(zhì)量分數(shù)、電泳時間。本試驗在前期工作中對模板DNA含量、引物含量、dNTPs含量、Taq酶含量4個因素進行了優(yōu)化分析，進而建立了適合黨參材料的RAPD-PCR擴增反應(yīng)體系，并對引物退火溫度和電泳中瓊脂糖質(zhì)量分數(shù)進行了梯度篩選，最終確定黨參的最適RAPD-PCR體系為100 ng·μL-1模板DNA 1 μL，10 μmol·L-1隨機引物2 μL，2.5 μmol·L-1dNTPs 1 μL，10×Buffer 2.5 μL，2.5 U·μL-1Taq酶 0.5 μL，ddH2O 18 μL；RAPD引物最佳退火溫度為34.5 ℃，最適瓊脂糖質(zhì)量分數(shù)為1.2%。此體系的建立可為其他黨參品種的RAPD擴增提供參照依據(jù)。

3.210個黨參材料間的遺傳相似性和多樣性 RAPD是一種顯性標(biāo)記，能從分子水平上揭示材料間存在的遺傳差異[14-16]。本研究從60條隨機引物中篩選出譜帶清晰并呈多態(tài)性的14條引物，結(jié)果證明其穩(wěn)定性較好。不同供試材料在同一引物的RAPD圖譜中的主譜帶基本一致，說明它們的遺傳背景具有很大的相似性，這是鑒定黨參真?zhèn)蔚闹匾獦?biāo)記，可以用于黨參藥材道地性鑒定。另外，不同品種的次譜帶之間存在不同程度的差異，說明不同黨參品系間的遺傳背景也具有一定的多樣性。遺傳相似性及聚類分析表明，甘肅省黨參種質(zhì)資源間的變異范圍較小，種間遺傳關(guān)系較近。這種情況可能是在黨參種植過程中，各個品種之間的地理分布近，并且桔?？浦参锒酁楫惢ㄊ诜郏瑥亩裹h參品種間相互授粉的幾率大大提高，造成種間的遺傳關(guān)系較近。本研究中品種DS8和品種DS10分別為選育黨參品種渭黨1號和渭黨2號。品系DS3與品種DS8的親緣關(guān)系最近，其相似系數(shù)為0.964 9，二者可以進一步與品系DS1聚為一類，這3個材料與品種DS10(渭黨2號)的遺傳距離較遠；品系DS6與其他所有供試材料的親緣關(guān)系最遠，可單獨聚為一類。本研究所得結(jié)果可為甘肅省黨參種質(zhì)資源的優(yōu)化提供部分分子生物學(xué)依據(jù)。

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