張萍萍，胡龍興，傅金民

(中國科學(xué)院植物種質(zhì)創(chuàng)新與特色農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國科學(xué)院武漢植物園，湖北 武漢430074)

土壤鹽漬化是一個(gè)世界性的資源與環(huán)境生態(tài)問題，全世界有各種類型鹽漬土約10億hm2，約占全球陸地總面積的1/4[1]。土壤中過量的鹽分對(duì)植物造成離子毒害和滲透脅迫等危害[2]，從而降低種子發(fā)芽率，抑制幼苗生長(zhǎng)[3]，已成為影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境的嚴(yán)重問題。種子萌發(fā)是植物生長(zhǎng)的關(guān)鍵階段，也是植物生長(zhǎng)過程中最為脆弱的時(shí)期，種子在萌發(fā)期對(duì)逆境的適應(yīng)性直接關(guān)系到成苗后植株的生長(zhǎng)狀況。因此，提高種子萌發(fā)期的耐鹽能力至關(guān)重要。

內(nèi)生真菌廣泛存在于植物的組織或器官中，與大部分禾草共生，并且可增加宿主的抗逆境能力[4-6]。Swarthout等[7]發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌可提高葦狀羊茅(Festucaarundinacea)的抗旱能力，王正風(fēng)等[8]發(fā)現(xiàn)帶內(nèi)生真菌的野大麥(Hordeumbrevisubulatum)比不帶內(nèi)生真菌的野大麥更耐鹽，于漢壽等[9]也發(fā)現(xiàn)種子含菌率高的葦狀羊茅和多年生黑麥草(Loliumperenne)在幼苗期有更強(qiáng)的抗蟲能力。多年生黑麥草是草地生態(tài)系統(tǒng)中重要的植物之一，也是一種優(yōu)良的冷季型草坪草，其優(yōu)良的抗逆性與其共生的內(nèi)生真菌有密切關(guān)系。已有研究表明，內(nèi)生真菌侵染多年生黑麥草可以提高宿主的抗病蟲、抗旱等能力[9-12]，但內(nèi)生真菌對(duì)多年生黑麥草在鹽脅迫下種子萌發(fā)的影響研究較少。本研究以NaCl模擬鹽脅迫環(huán)境，采用自然生長(zhǎng)狀態(tài)下不同內(nèi)生真菌侵染率的多年生黑麥草品種為材料，通過比較在鹽脅迫下的發(fā)芽率、活力指數(shù)、根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)、根/苗比等指標(biāo)，探討內(nèi)生真菌在多年生黑麥草種子耐鹽脅迫中所起的作用，以期找到內(nèi)生真菌與黑麥草耐鹽性的關(guān)系，為研究黑麥草-內(nèi)生真菌共生體關(guān)系打下基礎(chǔ)，為培育耐鹽植物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料 試驗(yàn)材料為16個(gè)多年生黑麥草品種的種子(表1)，參考南志標(biāo)[13]的方法檢測(cè)種子內(nèi)生真菌侵染率，其中8個(gè)品種的種子被內(nèi)生真菌低頻率侵染(≤20%)，另外8個(gè)品種的種子被內(nèi)生真菌高頻率侵染(≥80%)。

1.2試驗(yàn)方法 試驗(yàn)于溫室中進(jìn)行，室溫20～25 ℃，14 h光照。每個(gè)品種選取30粒均勻飽滿的種子播種于墊有雙層濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，濾紙分別用蒸餾水配成的不同濃度的NaCl溶液浸透，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，設(shè)定0(對(duì)照)、85、170、255 mmol·L-14個(gè)NaCl濃度梯度，每個(gè)濃度處理4個(gè)重復(fù)。每天加入適量蒸餾水以保持濾紙的濕度。從種子置床之后的第2天開始觀察，以胚根突破種皮為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，每日統(tǒng)計(jì)萌發(fā)種子數(shù)，至第15天測(cè)根長(zhǎng)和苗長(zhǎng)。

表1 16個(gè)多年生黑麥草品種的內(nèi)生真菌侵染率

1.3相關(guān)指標(biāo)的計(jì)算 根據(jù)如下公式計(jì)算發(fā)芽率(GR)、發(fā)芽指數(shù)(GI)和活力指數(shù)(VI)：

式中，DG為逐日發(fā)芽數(shù)，DT為相應(yīng)DG的發(fā)芽天數(shù)。

VI=GI×生長(zhǎng)勢(shì)(胚根長(zhǎng))；

相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)活力指數(shù)、相對(duì)根長(zhǎng)、相對(duì)苗長(zhǎng)、相對(duì)根苗比按照“相對(duì)性狀指標(biāo)(%)=各鹽濃度處理下的性狀測(cè)定值/對(duì)照的性狀測(cè)定值”進(jìn)行計(jì)算。

1.4數(shù)據(jù)處理 所得數(shù)據(jù)經(jīng)Microsoft Excel 2003處理分析和圖表制作，各相對(duì)性狀指標(biāo)采用SAS 9.0進(jìn)行兩因素方差分析和單因素方差分析，兩因素方差分析用于比較內(nèi)生真菌侵染率效應(yīng)、鹽脅迫處理效應(yīng)以及二者之間可能存在的交互作用。若差異顯著，采用LSD法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1鹽脅迫下內(nèi)生真菌對(duì)相對(duì)發(fā)芽率的影響 鹽脅迫下高內(nèi)生真菌侵染率種子和低內(nèi)生真菌侵染率種子的相對(duì)發(fā)芽率均有不同程度的下降(圖1)。低內(nèi)生真菌侵染率種子的相對(duì)發(fā)芽率隨著鹽濃度的增加而明顯下降，而高內(nèi)生真菌侵染率的種子在中、低濃度(≤170 mmol·L-1NaCl)鹽處理下的相對(duì)發(fā)芽率與對(duì)照差別不大，在高濃度鹽(255 mmol·L-1NaCl)處理下才顯著下降(P<0.05)，且在高鹽(255 mmol·L-1NaCl)處理下的相對(duì)發(fā)芽率顯著高于(P<0.05)低內(nèi)生真菌侵染率種子的相對(duì)發(fā)芽率。

圖1 鹽脅迫下不同內(nèi)生真菌侵染率多年生黑麥草種子的相對(duì)發(fā)芽率

2.2鹽脅迫下內(nèi)生真菌對(duì)相對(duì)活力指數(shù)的影響 各鹽度處理降低了低內(nèi)生真菌侵染率種子的相對(duì)活力指數(shù)，且隨著鹽濃度增加，相對(duì)活力指數(shù)下降程度增加。在高濃度鹽(255 mmol·L-1NaCl)處理下活力指數(shù)最小，降至對(duì)照的16.9%(圖2)。與對(duì)照相比，高內(nèi)生真菌侵染率種子的相對(duì)活力指數(shù)在低濃度(85 mmol·L-1NaCl)鹽處理下下降不明顯，在中濃度(170 mmol·L-1NaCl)和高濃度(255 mmol·L-1NaCl)鹽處理下明顯下降，分別降至對(duì)照的53.6%和22.5%。在低、中濃度鹽處理下，高內(nèi)生真菌侵染率和低內(nèi)生真菌侵染率種子的相對(duì)活力指數(shù)無顯著差異，在高濃度鹽(255 mmol·L-1NaCl)處理下，高內(nèi)生真菌侵染率種子的相對(duì)活力指數(shù)顯著高于(P<0.05)低內(nèi)生真菌侵染率種子。

圖2 鹽脅迫下內(nèi)生真菌不同侵染率多年生黑麥草種子的相對(duì)活力指數(shù)

2.3鹽脅迫下內(nèi)生真菌對(duì)相對(duì)根長(zhǎng)的影響 隨著鹽濃度的增加，高內(nèi)生真菌侵染率種子和低內(nèi)生真菌侵染率種子的相對(duì)根長(zhǎng)均呈先上升后下降的趨勢(shì)(圖3)。在低濃度鹽(85 mmol·L-1NaCl)處理下分別為對(duì)照的115.76%和109.97%，在中、高濃度鹽(≥175 mmol·L-1NaCl)處理下根長(zhǎng)均小于對(duì)照。在各鹽濃度處理下，高內(nèi)生真菌侵染率種子和低內(nèi)生真菌侵染率種子的相對(duì)根長(zhǎng)差異不顯著(P≥0.05)。

圖3 鹽脅迫下內(nèi)生真菌不同侵染率多年生黑麥草種子的相對(duì)根長(zhǎng)

2.4鹽脅迫下內(nèi)生真菌對(duì)相對(duì)苗長(zhǎng)的影響 隨著鹽濃度的增加，低內(nèi)生真菌侵染率種子的相對(duì)苗長(zhǎng)逐漸減小，高內(nèi)生真菌侵染率種子的相對(duì)苗長(zhǎng)呈先上升后下降的趨勢(shì)，且在低濃度鹽處理下有最大值，為對(duì)照的107.1%(圖4)。與對(duì)照相比，低內(nèi)生真菌侵染率種子的苗長(zhǎng)在低濃度鹽(85 mmol·L-1NaCl)處理下變化不明顯，在中、高濃度鹽(≥175 mmol·L-1NaCl)處理下顯著降低(P<0.05)。在低濃度鹽(85 mmol·L-1NaCl)處理下，兩組不同內(nèi)生真菌水平種子的相對(duì)苗長(zhǎng)差別不大，在中、高濃度鹽(≥175 mmol·L-1NaCl)處理下，高內(nèi)生真菌侵染率種子的相對(duì)苗長(zhǎng)顯著(P<0.05)大于低內(nèi)生真菌侵染率種子。

圖4 鹽脅迫下內(nèi)生真菌不同侵染率多年生黑麥草種子的相對(duì)苗長(zhǎng)

2.5鹽脅迫下內(nèi)生真菌對(duì)相對(duì)根苗比的影響 根苗比反映了根和苗生長(zhǎng)受鹽脅迫程度的差異。與對(duì)照相比，在低濃度鹽(85 mmol·L-1NaCl)處理下，不同內(nèi)生真菌侵染率種子的相對(duì)根苗比均無明顯變化；在中、高濃度鹽(≥175 mmol·L-1NaCl)處理下，根苗比均低于對(duì)照(圖5)。在同等鹽濃度處理下，高內(nèi)生真菌侵染率種子和低內(nèi)生真菌侵染率種子的相對(duì)根苗比差異不顯著(P≥0.05)。

3 討論與結(jié)論

鹽脅迫是作物生長(zhǎng)過程中常遇到的逆境脅迫之一，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來嚴(yán)重危害，它通過降低發(fā)芽率和活力指數(shù)，抑制根、芽生長(zhǎng)而影響種子萌發(fā)[14-16]。內(nèi)生真菌的菌絲生長(zhǎng)于植物的不同器官、組織細(xì)胞和細(xì)胞間隙中，分布于葉片、葉鞘、種子、花、莖、根中[17-18]，其存在不可避免地會(huì)對(duì)宿主種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)等一系列生命活動(dòng)產(chǎn)生影響。一般感染內(nèi)生真菌的植物比未感染內(nèi)生真菌的植物更具生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。Clay[19]發(fā)現(xiàn)，在良好的萌發(fā)條件下，內(nèi)生真菌侵染的黑麥草和高羊茅種子的發(fā)芽率均比相應(yīng)的未侵染種子高10%左右。南志標(biāo)[20]也發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌感染布頓大麥草(Hordeumbodganii)可增加每株的分蘗數(shù)及植株生物量。

圖5 鹽脅迫下內(nèi)生真菌不同侵染率多年生黑麥草種子的相對(duì)根苗比

逆境脅迫下，內(nèi)生真菌對(duì)宿主也起著重要影響。宋梅玲等[21]發(fā)現(xiàn)，在溫度脅迫和干旱脅迫下，攜帶內(nèi)生真菌的野大麥種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)均高于未攜帶內(nèi)生真菌的野大麥種子。任安芝等[22-23]的研究也表明，在高濃度PEG處理下，內(nèi)生真菌侵染提高了黑麥草種子的發(fā)芽率，但在低濃度PEG脅迫下，內(nèi)生真菌侵染對(duì)黑麥草種子的發(fā)芽率影響不大。本研究中，內(nèi)生真菌侵染對(duì)鹽脅迫下多年生黑麥草種子的萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)均有明顯影響，在正常萌發(fā)條件(對(duì)照)和低濃度(85 mmol·L-1NaCl)、中濃度(170 mmol·L-1NaCl)鹽脅迫下，內(nèi)生真菌侵染對(duì)種子萌發(fā)率、活力指數(shù)、根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)的影響不大，但在高濃度鹽(255 mmol·L-1NaCl)脅迫下，內(nèi)生真菌起著明顯的增益作用，表現(xiàn)在高內(nèi)生真菌侵染率種子的萌發(fā)率、活力指數(shù)、苗長(zhǎng)等指標(biāo)的下降程度均小于低內(nèi)生真菌侵染率種子。

在本研究中，無論是高內(nèi)生真菌感染率種子還是低內(nèi)生真菌感染率種子其發(fā)芽率、活力指數(shù)、根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)等在中高鹽脅迫下均受到不同程度地抑制，這與王秀香等[24]、劉萍等[25]的研究結(jié)果一致。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，低濃度鹽脅迫下根長(zhǎng)增加，而在中、高濃度鹽處理下則顯著下降，且高侵染率和低侵染率品種之間無顯著差異，表明內(nèi)生真菌對(duì)鹽脅迫下黑麥草根系的伸長(zhǎng)沒有明顯的增益作用，適度的鹽脅迫可促進(jìn)根系伸長(zhǎng)，增強(qiáng)根系的吸收作用，提高耐鹽性，這可能是黑麥草耐鹽的機(jī)制之一。低侵染率品種的苗長(zhǎng)隨鹽濃度增加而降低，但高侵染率品種的苗長(zhǎng)在低濃度鹽脅迫下增加，在中高濃度鹽脅迫下降低，且根/苗隨著鹽度增加而下降。這說明黑麥草幼苗對(duì)鹽的敏感程度小于根，內(nèi)生真菌對(duì)鹽脅迫下黑麥草幼苗的增益作用明顯大于根系。前人也有研究表明醉馬草[26](Achnatheruminebrians)和紅花[3](Carthamustinctorius)在種子萌發(fā)期，根比苗對(duì)鹽更敏感，這可能是根直接與鹽接觸，導(dǎo)致受害更嚴(yán)重[27]。

內(nèi)生真菌也并不總是對(duì)逆境中的宿主起增益作用，Cheplick等[28]發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下，內(nèi)生真菌減少黑麥草分蘗量，在干旱處理后的恢復(fù)期間，增益作用也甚微；任安芝[29]的研究也表明內(nèi)生真菌并不能有效增強(qiáng)黑麥草的抗鹽性。這可能是內(nèi)生真菌與宿主的相互作用因基因型而異[28，30]，在前人的研究中，多是對(duì)某一基因型的感染內(nèi)生真菌和未感染內(nèi)生真菌植株進(jìn)行比較，因而出現(xiàn)不盡相同的結(jié)果。在本試驗(yàn)中，內(nèi)生真菌對(duì)宿主在高濃度NaCl脅迫下起著明顯的增益作用，說明在自然狀況下，內(nèi)生真菌對(duì)提高宿主多年生黑麥草的抗鹽能力起著增強(qiáng)作用。

綜上所述，鹽脅迫抑制了多年生黑麥草種子的萌發(fā)，而內(nèi)生真菌侵染對(duì)多年生黑麥草種子在鹽脅迫下的萌發(fā)具有增益作用，但增益程度與鹽脅迫程度有關(guān)。在高鹽脅迫下，高內(nèi)生真菌侵染率種子的萌發(fā)率、活力指數(shù)、苗長(zhǎng)等指標(biāo)的下降程度均小于低內(nèi)生真菌侵染率種子，說明自然狀況下侵染內(nèi)生真菌的多年生黑麥草在鹽脅迫下具有更強(qiáng)的適應(yīng)性。

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