丁博文，嵇 武，白小武，車金輝，張 強，李秋榮

腸黏膜屏障包括機械屏障、免疫屏障、微生物屏障和化學屏障，機械屏障是腸黏膜屏障的基礎和最重要的部分［1］。緊密連接形成的連續(xù)環(huán)周上皮細胞間連接，是構成腸黏膜機械屏障最重要的結構［2］。大黃素是中藥大黃的重要單體，具有多種功效，如抑菌、抗炎、改善微循環(huán)、抗癌等，具有較好的臨床應用價值［3］，近來有研究證實大黃素對腸黏膜屏障具有一定的保護作用。本實驗通過建立腸上皮細胞缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)模型，研究大黃素對緊密連接蛋白的影響，探討大黃素保護腸黏膜屏障的內在機制。

1 材料與方法

1.1 材料 腸上皮細胞株Caco-2 細胞(中國科學院上海細胞生物學研究所)、大黃素(江蘇食品藥品檢定所，純度＞99.9%)、Mllicell 插入式培養(yǎng)皿(Millipore 公司)、兔抗鼠多克隆緊密連接蛋白Occludin 和ZO-1 抗體(Santa Cruz 公司)、辣根過氧化物酶(HRP)-羊抗兔二抗(Sigma 公司)、RT-PCR 試劑盒(北京全式金生物公司)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物(北京全式金生物公司)。

1.2 主要實驗儀器 紫外分光光度計(Beckman Coulter)、JEM-1010 透射電子顯微鏡(日本電子株式會社)、MillicellTM 電阻測定系統(tǒng)(Millipore 公司)。

1.3 Caco-2 細胞的培養(yǎng) Caco-2 細胞在37℃、5%CO2和90%相對濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 ～3 d換液一次，每5 d 按1:3 的比例傳代。Caco-2 細胞接種于6 孔培養(yǎng)板內，供Western-blot 及RT-PCR 分析;接種于Millicell 聚碳酸酯膜(4.5cm2，0.4 μm)，供跨上皮電阻值(transepithelial electrical resistance，TEER)的檢測及透射電鏡分析。

1.4 Caco-2 細胞H/R 損傷模型的建立方法 取生長達到80%～90%融合的Caco-2 細胞，隨機分為四組:正常細胞(N)組、H/R 組、缺氧復氧+Hanks 平衡鹽溶液(H/R+HBSS)組、缺氧復氧+大黃素(H/R+EN)組。H/R+EN 組細胞在H/R 前30 min 用10 μmol/L 大黃素處理。將細胞置入密閉容器中，通入95%N2、5%CO2的混合氣體后將容器置于培養(yǎng)箱中孵育90 min(缺氧)，取出，置入培養(yǎng)箱中孵育2 h(復氧)。

1.5 TEER 值的檢測 用MillicellTM 電阻測定系統(tǒng)測定Caco-2 細胞單層的TEER 值。TEER 是反映腸黏膜屏障通透性的主要指標之一，與細胞單層的通透性在一定范圍內呈負相關。

1.6 透射電鏡觀察細胞間緊密連接的變化 將Millicell 聚碳酸酯膜剪下，依次經固定、脫水、包埋、修塊、切片，用醋酸鈾、硝酸鉛雙重染色，透射電鏡照相。

1.7 Western blot 檢測 將刮取得到的Caco-2 細胞加入細胞裂解液提取蛋白，考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度。取樣品蛋白40 μg，以聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳分離蛋白質，濕轉移法將蛋白條帶轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。加入兔抗鼠Occludin、ZO-1 一抗(1:500 稀釋)，4℃下孵育過夜，加入羊抗兔HRP-IgG 抗體(1:3000 稀釋)，室溫孵育1 h，ECL 法顯色。相應蛋白表達值為條帶的灰度值除以β-actin 灰度值。

1.8 RT-PCR 檢測 按照Trizol 說明書方法提取Caco-2 細胞總RNA，紫外分光光度計測量計算RNA純度和濃度。在20μl 逆轉錄反應體系中，以2.0μg的mRNA 為模板將mRNA 逆轉錄為cDNA。PCR 反應以GAPDH 為內參，使用Primer5.0 軟件設計引物序列(表1)。反應條件:95℃5 min，95℃5 s，62℃15 s，72℃1 min。PCR 擴增循環(huán)35 次。PCR 反應產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，數(shù)字成像儀照相分析，結果以Occludin/GAPDH、ZO-1/GAPDH 的整合光密度值(integrated density value，IDV)的比值表示。

表1 RT-PCR 引物序列及長度

2 結 果

2.1 TEER 值的檢測 與N 組比較，H/R、H/R+HBSS 和H/R+EN 三組TEER 值顯著降低(P ＜0.05);H/R、H/R+HBSS 兩組TEER 值明顯低于H/R+EN 組(P ＜0.05);H/R、H/R+HBSS 兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05，表2)。

表2 各組Caco-2 細胞TEER 值檢測結果)

表2 各組Caco-2 細胞TEER 值檢測結果)

注:與N 組比較，*P ＜0.05;與H/R+EN 組比較，#P ＜0.05

組別 n 檢測結果(%初始TEER)N 組12 100.38±4.28 H/R+EN 組 12 46.83±11.83*H/R 組 12 24.50±9.19*#H/R+HBSS 組 12 25.25±8.11*#

2.2 透射電鏡檢測緊密連接 N 組緊密連接完整清晰;H/R+EN 組緊密連接可見腫脹，但結構仍比較清晰;H/R、H/R+HBSS 組緊密連接結構腫脹模糊，破壞明顯(圖1)。

2.3 Western blot 檢測Occludin 和ZO-1 蛋白的表達 與N 組相比，H/R+EN、H/R、H/R+HBSS三組Occludin 和ZO-1 蛋白表達水平明顯降低(P ＜0.05);H/R、H/R+HBSS 兩組的ZO-1 和Occludin蛋白表達水平顯著低于H/R+EN 組(P ＜0.05);H/R、H/R+HBSS 兩組間差異無明顯統(tǒng)計學意義(P ＞0.05，圖2、表3)。

圖1 Caco-2 細胞的透射電鏡變化(醋酸鈾、硝酸鉛雙重染色 ×25 000)

圖2 各組Caco-2 細胞中Occludin、ZO-1 蛋白的表達

表3 各組Caco-2 細胞中Occludin、ZO-1 蛋白的相對表達(%)

表3 各組Caco-2 細胞中Occludin、ZO-1 蛋白的相對表達(%)

注:與N 組比較，*P ＜0.05;與H/R+EN 組比較，#P ＜0.05

組別 n Occludin 蛋白 ZO-1蛋白N 組6 100±14.73 100±9.56 H/R+EN 組 6 64.35±7.10* 57.45±8.17*H/R 組 6 38.30±4.20*# 29.51±6.39*#H/R+HBSS 組 6 34.37±4.82*# 32.49±5.81*#

2.4 RT-PCR 檢測Occludin 和ZO-1 的mRNA 表達

相對于N 組，H/R+EN、H/R、H/R+HBSS 三組ZO-1 和Occludin 的mRNA 表達水平明顯下調(P ＜0.05);H/R、H/R+HBSS 兩組的ZO-1 和Occludin的mRNA 表達水平顯著低于H/R+EN 組(P ＜0.05);H/R、H/R+HBSS 兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05，圖3、表4)。

圖3 各組Caco-2 細胞中ZO-1、Occludin mRNA 的表達

表4 各組Caco-2 細胞中ZO-1、Occludin mRNA 的表達()

表4 各組Caco-2 細胞中ZO-1、Occludin mRNA 的表達()

注:與N 組比較，*P ＜0.05;與H/R+EN 組比較，#P ＜0.05

組別 n Occludin mRNA ZO-1mRNA N 組6 0.808±0.117 0.952±0.101 H/R+EN 組 6 0.648±0.061* 0.752±0.031*H/R 組 6 0.431±0.014# 0.535±0.016*#H/R+HBSS 組 6 0.464±0.025*# 0.484±0.051*#

3 討 論

腸黏膜屏障具有防止腸道內病原微生物及毒素由腸腔侵入腸外器官的作用，以機械屏障最為重要，其基礎為單層上皮細胞和細胞間的緊密連接［4］。ZO-1、Occludin 是構成緊密連接的兩種重要組成部分［5］。ZO-1 與ZO-2 形成穩(wěn)定的復合體，直接結合Occludin 蛋白，形成一個網絡支架，將Occludin 和肌動蛋白系統(tǒng)連接在一起形成穩(wěn)定的連接系統(tǒng)，在信號傳導過程中起轉化作用，從而控制細胞周圍屏障［6］。

腸黏膜屏障功能的損害是一復雜的過程，諸多因素可能參與了這一過程的調控。目前的治療有給予腸內營養(yǎng)支持等［7］，但其具體的作用機制未完全闡明。大黃素曾長期作為導瀉、抗炎藥使用。許多研究證實大黃素可以顯著降低腫瘤壞死因子(TNFα)和白細胞介素-6(IL-6)的表達水平以及過氧化物酶(MPO)的活性［8-9］。大黃素具有的潛在細胞因子抑制作用是由于它抑制了核因子(NF-κB)的活性。大黃素還具有清除氧自由基抗氧化作用，增加超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化酶的活性，減少丙二醛含量等［10］。

本研究通過體外培養(yǎng)腸上皮細胞株Caco-2 細胞制作H/R 模型模擬腸缺血/再灌注(I/R)損傷。腸缺血時，腸系膜血管處于低灌注狀態(tài)，導致腸絨毛上皮細胞壞死脫落，腸黏膜屏障功能受損、腸通透性增加;再灌注后，產生大量氧自由基，造成組織細胞氧化應激損傷，進一步削弱腸屏障功能［11］。H/R 損傷后Western blot 和RT-PCR 檢測結果顯示，Caco-2細胞Occludin、ZO-1 蛋白的表達量和mRNA 的表達水平均明顯下降。ZO-1 蛋白表達減少會引起Occludin 等跨膜蛋白從細胞骨架上解離，Occludin 蛋白表達減少可使其封閉細胞旁縫隙的能力缺失，引起緊密連接開放［12］。透射電鏡下觀察到Caco-2 細胞間緊密連接結構破壞明顯，TEER 值顯著下降，Caco-2 單層細胞通透性大幅上升進一步證實腸黏膜屏障的完整性受到嚴重破壞，屏障功能下降。大黃素處理組Occludin、ZO-1 的蛋白表達量和mRNA 的表達水平明顯上升，表明大黃素對緊密連接結構蛋白在蛋白表達水平和基因轉錄水平都具有顯著的保護作用。電鏡觀察也顯示細胞間緊密連結構的破壞減輕，TEER 值升高，證實大黃素可以有效抑制Caco-2單層細胞通透性增加，保護腸上皮細胞的屏障功能。

因此，我們推測大黃素對腸黏膜屏障功能的保護作用可能是通過減少緊密連接結構蛋白Occludin、ZO-1 的破壞，增加其表達，維持腸黏膜屏障的完整性來實現(xiàn)的。本研究對于大黃素對腸黏膜屏障損傷的治療提供了部分理論依據，提示大黃素在治療消化系統(tǒng)疾病中具有很大潛力。

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