王玉風(fēng) 楊 俠 董曉光

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一。研究發(fā)現(xiàn)，隨著DR的病情發(fā)展，不僅影響了患者的視覺特異性日?；顒樱?］，而且已成為工作年齡段人群致盲的主要原因［2］。因此從分子和基因水平尋找更有效的方法來預(yù)防和阻止DR的發(fā)生和發(fā)展具有重要意義。

視網(wǎng)膜缺血、缺氧引起多種細(xì)胞因子釋放被認(rèn)為是DR中視網(wǎng)膜新生血管形成的主要原因［1，3］。但生理、病理性的血管生長，除了與生長因子相關(guān)外，還與細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的相互作用密切相關(guān)［4-5］。ECM成分和細(xì)胞表面受體結(jié)合，可介導(dǎo)細(xì)胞黏附，誘導(dǎo)細(xì)胞的接觸趨向性，使細(xì)胞發(fā)生定向遷移，這是血管生成中內(nèi)皮細(xì)胞遷移的機(jī)制之一［5］。而玻連蛋白(vitronectin，VN)是ECM的一個重要組成成分，它可以同多種受體結(jié)合，參與細(xì)胞纖溶、黏附、增殖、遷移、凋亡等過程［6-8］。

Seiffert等［9］在研究鼠類胚胎發(fā)育過程中基因表達(dá)時，發(fā)現(xiàn)VN可能是中樞神經(jīng)系統(tǒng)特有的一個血管標(biāo)記物。本課題組在前期的動物實(shí)驗(yàn)中，制作了小鼠氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變模型，小鼠全基因組表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，VN在視網(wǎng)膜血管正常發(fā)育過程中及氧濃度變化的影響下均有明顯的基因表達(dá)差異，并且在血管發(fā)育旺盛期和異常血管生長茂盛期的表達(dá)有顯著差異，但目前尚無體外研究證明VN在正常和高糖環(huán)境下的表達(dá)也存在差異，也沒有證實(shí)VN在視網(wǎng)膜新生血管病變中發(fā)揮何種作用。本研究模擬DR中內(nèi)皮細(xì)胞所處的高糖微環(huán)境，建立高糖體外細(xì)胞培養(yǎng)模型，通過檢測不同培養(yǎng)狀態(tài)下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)中VN的表達(dá)水平，以及細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)、細(xì)胞遷移能力、細(xì)胞成管能力的改變，初步探討VN與高糖環(huán)境下HUVEC發(fā)生一系列改變的關(guān)系，為進(jìn)一步證實(shí)VN的作用提供前期研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 HUVEC由北卡羅來納大學(xué)Cora-Jean S.Edgell惠贈。DMEM培養(yǎng)基干粉(美國Invitrogen公司)，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(美國Sigma公司)，注射用青霉素鈉(哈藥集團(tuán)制藥總廠)，注射用硫酸鏈霉素(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司)，胰蛋白酶(美國Gibco公司)，VN小鼠抗人單克隆抗體(美國Santa Cruz生物技術(shù)公司)，山羊抗小鼠IgG抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，小鼠抗GAPDH抗體(上?？党缮锕こ逃邢薰?，Western blot發(fā)光劑(美國Thermo公司)，F(xiàn)ITC-Phalloidin(鬼筆環(huán)肽)(中國聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 HUVEC的培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組 用DMEM培養(yǎng)基、含體積分?jǐn)?shù)10%FBS、100×103U·L－1青霉素和100×103U·L－1鏈霉素培養(yǎng)HUVEC。待細(xì)胞達(dá)80%融合時進(jìn)行分組處理，正常組:常規(guī)培養(yǎng)HUVEC，使用 DMEM培養(yǎng)基、含體積分?jǐn)?shù)2%FBS、100× 103U·L－1青霉素和100×103U·L－1鏈霉素培養(yǎng)，其中含葡萄糖濃度為25 mmol·L－1;高糖組:高糖培養(yǎng)HUVEC，使用DMEM培養(yǎng)基、含278 mmol·L－1葡萄糖、體積分?jǐn)?shù)2%FBS、100×103U·L－1青霉素和100×103U·L－1鏈霉素培養(yǎng)，其中含葡萄糖濃度為50 mmol·L－1。

1.2.2 Western blot方法檢測各組中VN蛋白表達(dá)

將HUVEC接種于6孔板中，分別在24 h和48 h時提取培養(yǎng)液上清中的蛋白和細(xì)胞總蛋白，制備電泳凝膠，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。以1∶500稀釋的VN小鼠抗人單克隆抗體和1∶3000稀釋的山羊抗小鼠IgG抗體孵育VN條帶膜，以1∶2000稀釋的小鼠抗GAPDH抗體孵育GAPDH條帶膜。反應(yīng)結(jié)束后用Western blot熒光劑發(fā)光、顯影。利用Image J軟件對顯影結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.3 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法觀察各組中細(xì)胞微絲骨架F-actin的變化 將HUVEC接種于24孔板中，板中提前放入經(jīng)過酸洗、高壓滅菌處理的蓋玻片，分別在24 h和48 h時，將24孔板中的培養(yǎng)液完全吸除，無菌PBS洗滌5 min×3次。40 g·L－1多聚甲醛室溫固定 10 min，無菌 PBS洗滌 5 min×3次。50 g·L－1BSA室溫封閉20 min。1∶200稀釋的FITC-Phalloidin室溫避光染色30 min，PBS洗滌5 min×3次，甘油封片，用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞微絲骨架F-actin的變化并照相。

1.2.4 劃痕法檢測各組中細(xì)胞的遷移能力 將HUVEC接種于24孔板中，在0 h時，用100 μL微量移液槍頭對2組細(xì)胞進(jìn)行垂直劃痕，寬度控制在500 μm左右，PBS沖洗細(xì)胞2次，分別加入2組的培養(yǎng)液，置于37℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在0 h、24 h和48 h時，對2組細(xì)胞劃痕進(jìn)行照相，隨機(jī)選取6個視野計算遷移到劃痕內(nèi)的細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 Matrigel法檢測各組中細(xì)胞的成管能力將Matrigel基質(zhì)膠置于4℃冰箱中2 h，使其完全溶解。向預(yù)冷的48孔板中加入Matrigel基質(zhì)膠，每孔150 μL，37℃ 1 h成膠。將接種于6孔板中的細(xì)胞在分組處理后0 h消化，分別用2組的培養(yǎng)液重懸，以70×106L－1接種于已鋪好膠的48孔板中，置于37℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在6 h和12 h時，對2組細(xì)胞進(jìn)行照相，隨機(jī)選取6個視野計算形成閉合血管腔的數(shù)目。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以s表示，各樣本首先進(jìn)行方差齊性分析，再采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組VN蛋白表達(dá) 培養(yǎng)24 h時，高糖組中VN的蛋白表達(dá)量(1.295±0.080)高于正常組(0.893±0.119)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=－4.857， P＜0.05);培養(yǎng)48 h時，高糖組中VN的蛋白表達(dá)量(1.724±0.098)亦高于正常組(0.874±0.115)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=－9.710，P＜0.05，見圖1)。

2.2 2組細(xì)胞微絲骨架F-actin變化 細(xì)胞微絲骨架F-actin包括三種結(jié)構(gòu):板狀偽足、絲狀偽足和應(yīng)力纖維。板狀偽足，是細(xì)胞邊緣呈薄蓋狀擴(kuò)張的平坦網(wǎng)狀組織;絲狀偽足，是細(xì)胞邊緣直徑約為0.15 μm的微刺狀結(jié)構(gòu);應(yīng)力纖維是位于板狀偽足的基部或劃界于細(xì)胞邊緣的細(xì)絲狀結(jié)構(gòu)。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)合熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)24 h及48 h時，高糖組中貫穿于細(xì)胞全長的繩索狀結(jié)構(gòu)更加密集，且呈現(xiàn)出具有強(qiáng)穿透力的小簇狀，細(xì)胞邊緣微刺狀結(jié)構(gòu)也更明顯，細(xì)胞邊緣更加銳利(圖2)。

2.3 2組細(xì)胞遷移能力 培養(yǎng)24 h時，正常組和高糖組中遷移到劃痕內(nèi)的細(xì)胞數(shù)分別為(198.000± 15.880)個、(242.000±11.130)個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=－5.495，P＜0.05);培養(yǎng)48 h時，正常組和高糖組中遷移到劃痕內(nèi)的細(xì)胞數(shù)分別為(293.000± 8.681)個、(334.000±10.863)個，差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(t=－7.193，P＜0.05，見圖3)。

Figure 1 VN protein expression in two groups 2組VN蛋白表達(dá)

Figure 2 F-actin immunofluorescence images in two groups(×400).A:Normal glucose group at 24 hours;B:High glucose group at 24 hours;C: Normal glucose group at 48 hours;D:High glucose group at 48 hours 2組F-actin結(jié)構(gòu)分布免疫熒光圖像(×400)。A:正常組培養(yǎng)24 h;B:高糖組培養(yǎng)24 h;C:正常組培養(yǎng)48 h;D:高糖組培養(yǎng)48 h

Figure 3 Cell migration images in two groups(×100).A:Normal glucose group at 24 hours;B:High glucose group at 24 hours;C:Normal glucose group at 48 hours;D:High glucose group at 48 hours2組細(xì)胞遷入劃痕圖像(×100)。A:正常組培養(yǎng)24 h;B:高糖組培養(yǎng)24 h;C:正常組培養(yǎng)48 h;D:高糖組培養(yǎng)48 h

2.4 2組細(xì)胞成管能力 培養(yǎng)6 h時，正常組、高糖組中形成的閉合血管腔數(shù)目分別為(91.000± 9.867)個、(120.000±9.813)個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=－5.163，P＜0.05);培養(yǎng)12 h時，正常組、高糖組中形成的閉合血管腔數(shù)目分別為(8.000±3.011)個、(19.000±3.209)個，差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(t=－5.659，P＜0.05，見圖4)。

3 討論

一直以來視網(wǎng)膜缺血、缺氧引起的多種細(xì)胞因子的釋放被認(rèn)為是視網(wǎng)膜新生血管形成的主要原因，內(nèi)皮細(xì)胞在細(xì)胞因子的刺激下，激活分泌蛋白酶，蛋白酶溶解血管基底膜和周細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，微血管內(nèi)皮細(xì)胞通過血管基底膜遷移進(jìn)入鄰近細(xì)胞外間質(zhì)形成新生血管芽［1，3］。但新生血管的形成是一個復(fù)雜的過程，還與其他多種分子生物學(xué)作用相關(guān)，如細(xì)胞和ECM間的相互作用。ECM是細(xì)胞分泌到細(xì)胞外間質(zhì)中的大分子物質(zhì)，主要包括膠原蛋白、纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、層粘連蛋白(laminin，LN)、VN等多種成分。一旦內(nèi)皮細(xì)胞匯集形成新的血管，這些ECM成分就形成基底膜以穩(wěn)定和維持血管結(jié)構(gòu)，這個基底膜緊緊黏附于由細(xì)胞組成的血管墻上，提供誘發(fā)信號，在新生血管的自我穩(wěn)定中起重要作用。眾多學(xué)者多關(guān)注ECM中膠原蛋白和FN的研究，而對VN的研究相對較少。VN是個多功能的黏附糖蛋白，它不僅存在于ECM中，還存在于血漿和血小板中，而且它的構(gòu)象易變，在血漿中以單體形式存在，在血小板和ECM中多以多聚體形式存在［6-7］，而這種構(gòu)象的改變與其功能密切相關(guān)。多聚體形式的VN，可以優(yōu)先同一些受體，如整合素、尿激酶型纖溶酶原激活物受體(urokinase plasminogen activator receptor，uPAR)、纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)等結(jié)合，而這些受體的作用多與細(xì)胞纖溶、黏附、增殖、遷移、凋亡等密切相關(guān)［6-8］，都參與視網(wǎng)膜新生血管疾病的發(fā)生、發(fā)展［10-12］。因此我們推測，VN作為連接多種血管形成相關(guān)受體的特異性配體，可能在血管形成過程中處于“節(jié)點(diǎn)”的關(guān)鍵位置，即VN可能是影響視網(wǎng)膜新生血管疾病的一個重要因子。

Figure 4 Blood vessels formation in two groups(×40).A:Normal glucose group at 6 hours;B:High glucose group at 6 hours;C:Normal glucose group at 12 hours;D:High glucose group at 12 hours2組細(xì)胞形成管腔的情況(×40)。A:正常組培養(yǎng)6 h;B:高糖組培養(yǎng)6 h;C:正常組培養(yǎng)12 h;D:高糖組培養(yǎng)12 h

人視網(wǎng)膜材料來源有限，進(jìn)行人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)也比較困難，很難獲得純化的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞，傳代過程中細(xì)胞性狀也容易發(fā)生改變，且考慮到后期將進(jìn)一步進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)，可能會影響細(xì)胞的生長狀態(tài)，因此我們選用較易生長的HUVEC來進(jìn)行研究。

本研究通過在體外增加培養(yǎng)液中葡萄糖濃度的方法來培養(yǎng)HUVEC，模擬DR中內(nèi)皮細(xì)胞所處的高糖微環(huán)境，檢測VN表達(dá)水平的改變。從Western blot結(jié)果可以看出，用含25 mmol·L－1葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVEC 24 h、48 h后，VN蛋白表達(dá)變化不明顯，而用含 50 mmol·L－1葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVEC 24 h、48 h后，VN蛋白表達(dá)水平明顯增高。這與我們前期小鼠氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變動物模型中，全基因組表達(dá)譜分析的VN表達(dá)趨勢是一致的。

那么，高糖環(huán)境中VN的表達(dá)差異是否就說明VN與DR中由高糖血癥引起的一系列病理改變有關(guān)呢?高糖血癥及其引起的組織缺血、缺氧導(dǎo)致一系列病理改變，尤其是視網(wǎng)膜新生血管的形成，是DR的主要病理改變。新生血管形成的關(guān)鍵步驟之一是內(nèi)皮細(xì)胞的遷移［5］，正常情況下內(nèi)皮細(xì)胞有很強(qiáng)的極性，細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞間黏附緊密。當(dāng)細(xì)胞受到某些刺激后，如果細(xì)胞間連接變?nèi)?，?xì)胞呈散在、彌漫狀態(tài)生長，極性消失，細(xì)胞骨架就會發(fā)生劇烈變化，內(nèi)皮細(xì)胞獲得遷移的能力，促進(jìn)新生血管的形成［5］。

細(xì)胞骨架(包括微管、微絲和中間纖維)是細(xì)胞運(yùn)動、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞分裂和跨膜信息傳遞的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，是細(xì)胞外信號和核內(nèi)基因表達(dá)之間的橋梁，尤其是微絲骨架，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分化和運(yùn)動時微絲骨架會發(fā)生重構(gòu)［13-15］。細(xì)胞骨架的重構(gòu)實(shí)際上是細(xì)胞骨架蛋白發(fā)生變化的結(jié)果。因?yàn)榧?xì)胞骨架蛋白表面承載著高密度的負(fù)電荷，一些蛋白和特殊配體使得細(xì)胞形成胞質(zhì)膜-細(xì)胞骨架復(fù)合體，改變了細(xì)胞-細(xì)胞間、細(xì)胞-ECM間的連接，使得外界信號通過細(xì)胞骨架纖維的聚集或釋放最終作用于細(xì)胞內(nèi)的靶結(jié)構(gòu)。因此，細(xì)胞骨架蛋白可以稱為細(xì)胞表面催化劑和蛋白輔助因子［16］。F-actin屬于微絲的結(jié)構(gòu)蛋白，可以不斷地變?yōu)榘鍫顐巫?、絲狀偽足和應(yīng)力纖維結(jié)構(gòu)，這三種結(jié)構(gòu)對于驅(qū)動以肌動蛋白為基礎(chǔ)的內(nèi)皮細(xì)胞運(yùn)動非常重要［5，17］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在高糖培養(yǎng)HUVEC 24 h和48 h后，對細(xì)胞中的板狀偽足、絲狀偽足和應(yīng)力纖維刺激更加明顯，貫穿于細(xì)胞全長的繩索狀結(jié)構(gòu)更加密集，且呈現(xiàn)出具有強(qiáng)穿透力的小簇狀，細(xì)胞邊緣更加銳利。說明這些細(xì)胞的遷移能力更強(qiáng)，它們正處于或即將處于遷移狀態(tài)。因此在高糖微環(huán)境中，HUVEC發(fā)生了細(xì)胞骨架重塑。那么HUVEC骨架結(jié)構(gòu)的改變是否與VN的表達(dá)差異有關(guān)呢?Sastry等［18］早在1993年就發(fā)現(xiàn)，整合素可以通過β亞基的胞漿部分向細(xì)胞骨架傳遞信號，調(diào)節(jié)肌動蛋白細(xì)胞骨架的聚合作用。而整合素正是VN的受體之一，因此我們有理由相信，高糖環(huán)境中HUVEC的骨架重塑與VN表達(dá)水平的增高密切相關(guān)，干擾VN的表達(dá)有可能在一定程度上抑制細(xì)胞骨架重塑，但這些都需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

在新生血管形成的過程中，骨架重塑、細(xì)胞遷移、細(xì)胞成管這些過程都是密切相關(guān)的，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了在高糖培養(yǎng)的HUVEC中，細(xì)胞遷移能力、成管能力增強(qiáng)。在此要特別說明，Matrigel法檢測細(xì)胞成管能力實(shí)驗(yàn)中所選時間點(diǎn)之所以與其他實(shí)驗(yàn)步驟時間點(diǎn)不一致，是因?yàn)槲覀儼l(fā)現(xiàn)，6 h時細(xì)胞的成管現(xiàn)象較明顯，12 h時細(xì)胞已聚集成團(tuán)，其形成的管腔結(jié)構(gòu)變粗，成管數(shù)量也減少，24 h后，各組中都不再形成完整的閉合管腔，這可能與Matrigel基質(zhì)膠的特性有關(guān)(具體機(jī)制不明)?？傮w看來，HUVEC的成管趨勢與VN的表達(dá)趨勢是一致的，由此推測HUVEC成管能力的高低與VN的表達(dá)水平有關(guān)。

下一步實(shí)驗(yàn)我們將干擾VN的表達(dá)，觀察其表達(dá)改變后，是否對高糖環(huán)境中HUVEC的細(xì)胞骨架、細(xì)胞遷移能力、細(xì)胞成管能力產(chǎn)生影響，以便進(jìn)一步確定高糖環(huán)境中HUVEC發(fā)生的一系列改變是否與VN有關(guān)，進(jìn)而探討VN在DR發(fā)生、發(fā)展中的作用。

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