羅 程 鄭寶石何 巍 馮 旭 雷賓峰 彭 俊

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心胸外科，南寧市 530021)

同種帶瓣動(dòng)脈具有抗血栓、抗感染及良好的血流動(dòng)力學(xué)，廣泛應(yīng)用于治療先天性心臟病及瓣膜病，但移植后鈣化衰敗成為影響其療效的主要問(wèn)題［1］。臨床上經(jīng)常會(huì)遇到年輕患者同種瓣膜植入后發(fā)生早期的衰?。?，2］，這種結(jié)構(gòu)性衰敗可能是相關(guān)的免疫基礎(chǔ)。我們采用白兔同種帶瓣動(dòng)脈頸動(dòng)脈異位移植模型，對(duì)移植后不同時(shí)間段的免疫指標(biāo)和鈣含量進(jìn)行檢測(cè)，以探討環(huán)孢素預(yù)處理后同種瓣移植免疫排斥與鈣含量的改變及其意義。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用4周齡的白兔50只作為供體，體重0.30～0.35 kg。將8周的白兔50只，體重3.00～3.50 kg，隨機(jī)分成2組作為受體，25只接受環(huán)孢素預(yù)處理Hank's液+抗生素+CsA 30 mg/L保存為實(shí)驗(yàn)組，另外25只Hank's液+抗生素保存為對(duì)照組。

1.2 方法

1.2.1 試劑配制

1.2.1.1 環(huán)孢素配置液 環(huán)保素注射液(山地明) 5 ml/250 mg，用0.9%生理鹽水稀釋濃度為1 mg/mL。

1.2.1.2 工作液配制 1號(hào)工作液:參考王榮平等［3］的低濃度抗生素液配方，改良型Hank's液250 mL，分別加入先鋒霉素V(50 mg/L)、慶大霉素(5 000 U/L)、大蒜素(50.0 mg/L)，NaOH滴定至pH值在7.2～7.4之間。2號(hào)工作液:改良型RPMI-1640培養(yǎng)基，10%小牛血清，10%體積分?jǐn)?shù)二甲基亞砜8∶1∶1［4］。0.22 μm濾膜分別正壓過(guò)濾除菌，4℃冰箱保存。

1.2.2 血管處理 肌注麻醉后，常規(guī)消毒，直接開(kāi)胸，于主動(dòng)脈弓部分支前剪斷［5］，篩選瓣葉和血管壁內(nèi)膜光滑、無(wú)粥樣硬化斑和鈣化斑，瓣葉功能良好者為合格［6］。沖洗血管后置入1號(hào)工作液，4℃冰箱滅菌24 h。改良型Hank's液滅菌處理后隨機(jī)分為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組。加2號(hào)工作液為對(duì)照組，加2號(hào)工作液的同時(shí)另加入環(huán)孢素配置液為實(shí)驗(yàn)組。經(jīng)－20℃冰箱保存12 h后置入－196℃液氮罐保存。

1.2.3 移植血管 麻醉成功后，仰臥位固定，頸部去毛。行頸部正中縱行切口(2～3 cm)游離兩側(cè)頸動(dòng)脈，將一側(cè)頸動(dòng)脈兩端上動(dòng)脈夾，間隔1～1.5 cm。剪斷后立即向兩斷端滴注肝素鈉6 250 U加生理鹽水500 mL配置液［7］。8/0尼龍線將移植血管先吻合近心端后吻合遠(yuǎn)心端，打開(kāi)動(dòng)脈夾排氣。縫合頸部切口。術(shù)后予腸溶阿斯匹林(25 mg)1片，1次/d，口服抗生素。

1.2.4 CD25檢測(cè) 移植后2、4、8周采腔靜脈血，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD25的表達(dá)。

1.2.5 CD40檢測(cè) 取移植標(biāo)本后制作免疫組織化切片。隨機(jī)每例選取10個(gè)不重疊而完整的視野進(jìn)行分析，檢測(cè)CD40顆粒反應(yīng)陽(yáng)性的平均吸光度，該例的測(cè)量值為每張切片的均值。

1.2.6 檢測(cè)移植物的鈣含量 分別剪取適量血管壁和瓣葉組織樣本，去離子水充分漂洗，烘干(80℃，至少24 h)稱(chēng)重，原子吸收光譜法測(cè)定組織鈣含量(以每毫克組織干重計(jì))。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD25、CD40的表達(dá)情況 移植術(shù)后CD25、CD40的表達(dá)隨著時(shí)間的不同而變化，(%，±s)。實(shí)驗(yàn)組CD25、CD40的表達(dá)低于對(duì)照組(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 移植術(shù)后不同時(shí)間CD25和CD40的表達(dá) (μg/g，±s)

表1 移植術(shù)后不同時(shí)間CD25和CD40的表達(dá) (μg/g，±s)

組別 2周 4周 8周CD40 0.498±0.026 0.417±0.035 0.267±0.025 CD25 8.08±1.86 7.85±1.21 7.10±1.19對(duì)照組CD25 13.43±2.06 10.79±1.28 7.22±1.13實(shí)驗(yàn)組CD40 0.264±0.055 0.314±0.044 0.284±0.026對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組

2.2 移植血管鈣含量變化 移植血管鈣含量的檢測(cè)表明，實(shí)驗(yàn)組4、8、12周3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的鈣含量明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

表2 移植術(shù)后不同時(shí)間移植物的鈣含量 (μg/g，±s)

表2 移植術(shù)后不同時(shí)間移植物的鈣含量 (μg/g，±s)

組別 2周 4周 8周實(shí)驗(yàn)組 866.507±72.436 2 236.963±183.656 3 044.221±204.506對(duì)照組 862.788±172.213 3 000.806±103.083 3 790.652±242.572

3 討論

自1966年Ross等［8］首次應(yīng)用帶瓣血管治療肺動(dòng)脈閉鎖患者獲得成功后，深低溫保存、程控降溫、滅菌等技術(shù)推動(dòng)了同種帶瓣血管(Valve Homograft Conduit，VHC)在心臟外科手術(shù)中的應(yīng)用。復(fù)雜的心臟畸形矯正手術(shù)經(jīng)常需要同種組織或自體組織，但在臨床上經(jīng)常會(huì)遇到帶瓣血管退化的情況，年輕患者經(jīng)常可見(jiàn)到同種瓣膜、血管植入后的早期衰敗，這種衰敗可能有自身的免疫反應(yīng)基礎(chǔ)。免疫反應(yīng)造成血管內(nèi)膜增生、中膜壞死、外膜浸潤(rùn)，使血管出現(xiàn)血栓而最終失去功能［9］。目前眾多研究資料顯示，移植帶瓣血管后使用免疫抑制劑有抗鈣化的作用，抗鈣化的機(jī)理在于抑制移植后的免疫排斥反應(yīng)，可減輕平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞受到的免疫攻擊，從而保護(hù)平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。Bandlien KO等［2］發(fā)現(xiàn)用環(huán)孢素預(yù)處理同種組織然后移植到狗的同種靜脈，電鏡掃描發(fā)現(xiàn)退行性變減輕。對(duì)移植同種靜脈的狗應(yīng)用環(huán)孢素治療觀察后發(fā)現(xiàn)其移植血管存活率高［6］。從心臟瓣膜移植的患者(不使用免疫抑制劑治療)，Schoen等［10］發(fā)現(xiàn)瓣膜移植組細(xì)胞結(jié)構(gòu)顯著減少，并且有同種瓣膜上游T細(xì)胞存在。周江橋等［11］用含CSA(30 mg/L)液原位灌洗腎，提示CSA預(yù)處理對(duì)腎臟缺血－再灌注損傷有保護(hù)作用。

CD25是IL2的受體，是T細(xì)胞早期活化增殖的主要標(biāo)志［14，15］。CD40表達(dá)于抗原遞呈細(xì)胞和B細(xì)胞表面，調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫和體液免疫，在移植免疫排斥反應(yīng)中起重要作用［16］。分析移植血管鈣含量的趨勢(shì)和CD25、CD40的變化趨勢(shì)發(fā)現(xiàn)，移植后鈣化并沒(méi)有立即開(kāi)始，其鈣化是在4周才開(kāi)始的，并隨著時(shí)間的推移逐漸升高。

究其原因這是因?yàn)檠艿膬?nèi)皮細(xì)胞免疫原性最強(qiáng)，內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)平滑肌細(xì)胞，防止變性和鈣化［12］。移植后血管管壁是免疫排斥反應(yīng)發(fā)生的主要地點(diǎn)，最早壞死脫落的是內(nèi)皮細(xì)胞［13］。移植后早期受體血液循環(huán)中沖擊移植血管內(nèi)皮細(xì)胞，CD25和CD40表達(dá)，致免疫排斥反應(yīng)在移植早期發(fā)生。與此同時(shí)，內(nèi)彈力膜完整，平滑肌細(xì)胞未受到破壞，沒(méi)有發(fā)生鈣化。移植后4周內(nèi)皮細(xì)胞脫落，平滑肌細(xì)胞發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，出現(xiàn)壞死和鈣化。所以鈣含量在移植后4周升高。

綜上所述，移植后使用環(huán)孢素抑制了早期的免疫排斥反應(yīng)，保護(hù)了移植血管的內(nèi)皮細(xì)胞，降低了同種帶瓣血管的鈣化程度。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為同種異體常瓣大血管移植的臨床實(shí)踐提供了重要的參考價(jià)值。

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