黃維佳 覃家錦 何 巍 戴 霞 馮 旭 郭建極 冼 磊

(1廣西柳州市人民醫(yī)院心胸外科，柳州市 545001;2廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心胸外科，南寧市 530021)

近年來(lái)，他汀類(lèi)降脂藥物的“非調(diào)脂作用”引起了學(xué)者們的關(guān)注［1］，其中他汀類(lèi)藥物拮抗及逆轉(zhuǎn)肺動(dòng)脈高壓的作用是目前研究的熱點(diǎn)。瑞舒伐他汀是新近合成的新一代羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，其對(duì)于肺動(dòng)脈高壓的作用報(bào)道尚少，更未見(jiàn)到其對(duì)于左向右分流肺動(dòng)脈高壓影響的研究。本文通過(guò)左向右分流肺動(dòng)脈高壓大鼠模型，觀察瑞舒伐他汀干預(yù)后模型大鼠肺組織中肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡的變化及bcl-2蛋白表達(dá)的情況，初步探討瑞舒伐他汀對(duì)左向右分流肺動(dòng)脈高壓的影響及其可能機(jī)制，為今后臨床使用瑞舒伐他汀治療先心病繼發(fā)的肺動(dòng)脈高壓提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 SD大鼠(廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，瑞舒伐他汀鈣片(英國(guó)阿斯利康制藥有限公司)，多通道生理記錄儀(RM-6000，日本)，雙目顯微鏡(Olympus，日本)，電泳儀(Bio-Rad公司，美國(guó))，Q550CW計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)(Leica公司，德國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 隨機(jī)將36只SD大鼠分為3組(每組12只)。①分流給藥組:于分流手術(shù)第2天開(kāi)始予瑞舒伐他汀(10 mg/kg)灌胃，每天1次，連續(xù)給藥11周;②分流組:于分流手術(shù)第二天開(kāi)始予等體積0.9%生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)給藥11周;③對(duì)照組:常規(guī)開(kāi)腹但不做分流，手術(shù)后第二天開(kāi)始予等體積0.9%生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)給藥11周。

1.3 建模方法 對(duì)大鼠行腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)進(jìn)行麻醉，手術(shù)切口選取腹部正中切口，鈍性游離后腹膜，暴露腹主動(dòng)脈及下腔靜脈，在腹主動(dòng)脈的左腎動(dòng)脈開(kāi)口下方及髂總動(dòng)脈上方，分別用小動(dòng)脈夾夾閉，于腹主動(dòng)脈左側(cè)壁用尖刀片挑開(kāi)1 mm切口，用20 G套管針以45度角穿透腹主動(dòng)脈壁進(jìn)入鄰近的下腔靜脈內(nèi)，原則上不能刺破下腔靜脈對(duì)側(cè)管壁，反復(fù)穿刺后拔出針頭，用7-0滑線縫合腹主動(dòng)脈壁的切口，移走小動(dòng)脈夾，此時(shí)可觀察到大鼠下腔靜脈變粗，出現(xiàn)微弱搏動(dòng)，或顏色由暗變紅，均提示分流已形成。

1.4 平均肺動(dòng)脈壓(mPAP)及右心室肥厚指數(shù)(RVI)測(cè)定

經(jīng)腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉麻醉，游離右頸外靜脈，將聚乙烯導(dǎo)管經(jīng)右頸外靜脈插入大鼠肺動(dòng)脈，導(dǎo)管另一端接壓力換能器及多通道生理記錄儀，記錄mPAP。于大鼠心臟大血管根部切斷，取出心臟后分離右室游離壁(RV)、室間隔(S)及左室壁(LV)并分別稱(chēng)重，通過(guò)公式RVI=［RV/(LV+ S)］計(jì)算右心室肥厚指數(shù)。

1.5 HE染色 4%多聚甲醛固定大鼠肺組織，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色。應(yīng)用Olympus雙目顯微鏡觀察，每只大鼠隨機(jī)選取一張切片，每張切片中隨機(jī)選擇肺小動(dòng)脈15條，通過(guò)Q550CW計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行血管形態(tài)計(jì)量，測(cè)量平均血管總面積(TA)、血管腔面積(IA)、管壁厚度(WT)、血管外徑(ED)，通過(guò)公式WT%=(2×WT/ED)× 100%及WA%=(TA－IA)/TA×100%計(jì)算出管壁厚度占外徑的百分比(WT%)、管壁面積占血管總面積的百分比(WA%)，以反映肺血管重構(gòu)的程度。

1.6 大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 采用細(xì)胞凋亡原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)對(duì)切片進(jìn)行染色，按凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。計(jì)算隨機(jī)10個(gè)高倍視野(×400)中凋亡陽(yáng)性肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞數(shù)與其平滑肌細(xì)胞總數(shù)的比值(凋亡指數(shù)apoptotic index)，求其平均值。

1.7 大鼠肺組織中bcl-2蛋白的Western blot檢測(cè) 100 mg大鼠肺組織提取總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量，蛋白樣品與上樣緩沖液混合后于100℃下煮沸5 min。將樣品放在10%的SDS-聚丙烯凝膠中進(jìn)行電泳，后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉1 h后，分別加入 bcl-2抗體(1∶800)及β-actin抗體(1∶10 000)，并常溫下過(guò)夜。洗膜3次后加入二抗并作用1 h，按ECL說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行顯色，將膠片圖像輸入Q550CW計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)強(qiáng)度測(cè)定，以目的蛋白與β-actin的IOD值之比表示目的蛋白表達(dá)的相對(duì)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 13.0軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以mean士SD表示，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠平均肺動(dòng)脈壓力及右心室肥厚指數(shù)的變化 分流給藥組大鼠平均肺動(dòng)脈壓要明顯低于分流組，分別為(22.8±3.7)mmHg、(31.2±5.5)mmHg;同時(shí)，分流給藥組大鼠右心室肥厚指數(shù)也明顯低于分流組，分別為(38.5±6.4)%、(49.2±6.8)%。上述兩組間指標(biāo)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 HE染色顯示肺小動(dòng)脈形態(tài)的變化 經(jīng)過(guò)11周的干預(yù)，分流組、分流給藥組大鼠肺小動(dòng)脈管壁厚度占血管外徑百分比(WT%)分別為(35.3±4.1)%、(20.7±3.2)%，肺小動(dòng)脈管壁面積占血管總面積百分比(WA%)分別為(51.2±3.3)%、(31.6±3.9)%，分流給藥組大鼠肺小動(dòng)脈壁增厚、血管壁平滑肌細(xì)胞肥大增生、管壁面積增加、管腔狹窄等情況較分流組輕，肺血管重構(gòu)有明顯改善，上述兩組間指標(biāo)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠mPAP、RVI、WT%及WA%的變化

2.3 大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡的變化 光鏡下(×400)觀察TUNEL染色切片，凋亡的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞核被染成棕黃色。見(jiàn)圖1。對(duì)照組、分流給藥組、分流組大鼠肺組織中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞百分比(AI)分別是17.21±1.23、9.98±1.36、5.38±1.09，其中分流給藥組大鼠AI值要大于分流組，表明分流給藥組大鼠肺動(dòng)脈平滑肌凋亡的細(xì)胞較分流組多，各組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.4 大鼠肺組織中bcl-2蛋白表達(dá) 對(duì)照組、分流給藥組、分流組大鼠肺組織中 bcl-2蛋白的表達(dá)水平依次是1.19±0.12、1.52±0.47、2.27±0.56。可以看出，經(jīng)過(guò)瑞舒伐他汀干預(yù)能降低bcl-2蛋白的表達(dá)水平，各組間的變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)圖2。

圖1 各組大鼠光鏡下TUNEL染色切片

3 討論

先天性心臟病繼發(fā)的肺動(dòng)脈高壓發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全明確，如果不進(jìn)行積極干預(yù)，絕大多數(shù)病例將發(fā)展為艾森曼格綜合征，最終導(dǎo)致右心衰竭而死亡。目前可選擇的治療方法不多，如吸氧、抗凝劑、血管擴(kuò)張劑等治療效果有限，病程晚期只能考慮肺移植或心肺聯(lián)合移植。近年來(lái)，新型血管擴(kuò)張劑如血管緊張素受體拮抗劑纈沙坦、磷酸二酯酶5(PDE5)和抑制劑西地那非以及內(nèi)皮素受體拮抗劑波生坦相繼問(wèn)世，給肺動(dòng)脈高壓的藥物治療帶來(lái)希望［2］。但國(guó)外隨機(jī)前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，這些藥物雖然可以不同程度降低肺動(dòng)脈壓力、緩解患者癥狀，但不能明顯改善肺動(dòng)脈高壓病人的生存率，不能逆轉(zhuǎn)病變的進(jìn)程，而且存在明顯副作用，使患者對(duì)這些藥物的依從性較差，因此迫切需要尋找新的替代藥物。

他汀類(lèi)藥物屬于 3-羥基、3-甲基戊二酰輔酶 A (HMG-CoA)還原酶抑制劑，目前臨床上廣泛應(yīng)用于降低膽固醇的治療。最近大量的研究發(fā)現(xiàn)，他汀類(lèi)藥物除了抗脂質(zhì)生成作用外，還有許多非調(diào)脂藥理作用，當(dāng)中預(yù)防和逆轉(zhuǎn)肺動(dòng)脈高壓是目前學(xué)者們的研究熱點(diǎn)。研究表明，他汀類(lèi)藥物能有效治療肺動(dòng)脈高壓，可能與其誘導(dǎo)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、抑制靶細(xì)胞增殖有關(guān)。Knapp等［3］研究發(fā)現(xiàn)，脂溶性他汀藥物可誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞凋亡，這種效應(yīng)能被HMG-CoA還原產(chǎn)物羥甲戊酸所阻斷。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)他汀類(lèi)藥物通過(guò)促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白R(shí)ac1 GG化，增強(qiáng)Rac1的表達(dá)，能明顯促進(jìn)肺靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［4］。Toshihikl等［5］研究發(fā)現(xiàn)，與非脂溶性他汀類(lèi)藥物不同，脂溶性他汀類(lèi)藥物可以下調(diào)bcl-2基因表達(dá)，使Rho激酶異戊化，從而參與血管平滑肌細(xì)胞凋亡。此外，研究發(fā)現(xiàn)抑制rho-激酶、CDK4和CDK2激酶活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期也可能是他汀類(lèi)藥物抗增殖和促凋亡的機(jī)制［6，7］。

瑞舒伐他汀是羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑家族中的新成員，屬于氨基嘧啶衍生物，分子結(jié)構(gòu)為單一對(duì)映異構(gòu)羥酸鈣鹽，二羥基庚烯酸是分子中的共性藥效基團(tuán)。另外，瑞舒伐他汀結(jié)構(gòu)中的甲基磺酰胺基團(tuán)使整個(gè)分子具備低親脂性［8］，極易被肝細(xì)胞攝取，避免被肝細(xì)胞中細(xì)胞色素P450酶大量降解［9］，以上藥理特點(diǎn)使瑞舒伐他汀比同類(lèi)藥物更具有優(yōu)勢(shì)，比如對(duì)HMG-CoA還原酶更強(qiáng)大的抑制作用，更長(zhǎng)的藥物半衰期，更好的肝選擇性，更少的藥物交叉反應(yīng)，患者有更好的藥物耐受性。目前由于瑞舒伐他汀剛上市不久，其對(duì)于肺動(dòng)脈高壓相關(guān)影響的報(bào)道少見(jiàn)，更未見(jiàn)到他對(duì)于肺高血流性肺動(dòng)脈高壓相關(guān)作用的研究，也不清楚在肺高血流性肺動(dòng)脈高壓中瑞舒伐他汀的作用是否與相關(guān)靶細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，分流給藥組mPAP、WT%、WA%、RVHI值明顯低于分流組，說(shuō)明經(jīng)過(guò)瑞舒伐他汀干預(yù)，肺高血流模型大鼠肺動(dòng)脈壓力和肺血管重構(gòu)能得到有效緩解，大鼠右室?guī)缀螛?gòu)型的改變也得到抑制。同時(shí)，分流給藥組 bcl-2蛋白的表達(dá)明顯低于分流組，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞百分比(AI值)明顯高于分流組，凋亡的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞數(shù)量明顯上升，說(shuō)明瑞舒伐他汀緩解肺血管重構(gòu)可能是通過(guò)某些信號(hào)途徑抑制了凋亡抑制基因的表達(dá)，從而促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡。結(jié)合以往的研究結(jié)論，我們推測(cè):瑞舒伐他汀可能通過(guò)相關(guān)細(xì)胞信號(hào)途徑下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白如bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡，從而參與拮抗肺高血流性肺血管重構(gòu)的過(guò)程。

總之，瑞舒伐他汀促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡是其拮抗肺高血流性肺血管重構(gòu)的重要機(jī)制之一。本文初步探討了瑞舒伐他汀治療肺動(dòng)脈高壓的可能機(jī)理，但其復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和調(diào)控機(jī)制需要基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡明，以及該藥物是否能真正用于臨床也需要大量臨床實(shí)驗(yàn)的深入開(kāi)展。

圖2 各組大鼠bcl-2蛋白水平的變化

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