潘哲超， 徐 進， 顧 鋼， 吳 畏，許景升， 陳順輝， 馮 潔＊

（1．中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193；2．云南省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所，昆明 650205； 3．福建省煙草農(nóng)業(yè)科學研究所，福州 350003；4．西南大學植物保護學院，重慶 400715）

煙草青枯病是由茄科雷爾氏菌［Ralstonia sol anacear u m （Smit h）Yabuuchi et al．］引起的煙草生產(chǎn)上最具毀滅性的病害之一。該病1880年發(fā)現(xiàn)于美國的北卡羅來納州，1940年前后，該病于美國和印度尼西亞猖獗危害，此后，又逐漸成為日本、澳大利亞、韓國等許多產(chǎn)煙國家煙草上重要的細菌病害［1］。煙草青枯病在我國長江流域及其以南煙區(qū)普遍發(fā)生，其中以廣東、福建、湖南、四川及貴州煙區(qū)危害最為嚴重，個別年份的暴發(fā)流行可造成毀滅性損失［2］。近些年來，該病逐漸有擴展蔓延至北方煙區(qū)的趨勢，山東、河南、陜西及遼寧等省均有該病發(fā)生的報道，且局部地區(qū)危害較重［3］。

傳統(tǒng)的分類框架根據(jù)青枯菌的寄主范圍或?qū)?種雙糖和3種己醇的氧化利用情況，將其劃分為5個不同的生理小種（race）或5個生化變種（biovar）［4－7］。煙草青枯菌包括青枯菌1號生理小種的生化變種Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ（即R1／Bv1、R1／Bv3和R1／Bv4菌株）。

2005年，F(xiàn)egan和Prior［8］提出了青枯菌演化型分類框架（phylotype classification shemes），青枯菌被劃分為與地理起源密切相關(guān)的4個演化型—即演化型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型，在地理起源上依次對應(yīng)于亞洲分支、美洲分支、非洲分支以及印尼分支；每個演化型又由諸多序列變種（sequevar）構(gòu)成。序列變種定義為：以內(nèi)切葡聚糖酶基因（endogl ucanase，egl）進行系統(tǒng)發(fā)育分析時，一組序列高度保守的菌株集合體。演化型分類框架是建立在青枯菌基因組長期緩慢累積而形成的遺傳變異的基礎(chǔ)上，與傳統(tǒng)的小種及生化變種分類方法相比，演化型的分類框架可以更精確地反映青枯菌這一復(fù)合種的地理起源及種內(nèi)的遺傳多樣性。國際上的研究表明無毒基因avr A是控制青枯菌對煙草致病能力的決定因素之一，其于青枯菌群體中的分布也存在較大的差異性［9］，亞洲分支青枯菌無毒基因avr A存在RS1000類型和GMI1000類型的兩種類型［10］。

國內(nèi)目前對煙草青枯病菌系的研究大都遲滯于基于傳統(tǒng)方法的分類框架上［11－17］，僅鄭向華等［18］采用RAPD對廣東省煙草青枯菌的遺傳多樣性進行了研究。本研究采用國際上最新的演化型分類框架，對福建及貴州部分地區(qū)采集的煙草青枯病菌株進行系統(tǒng)發(fā)育分析并進行序列變種鑒定，并對各序列變種的無毒基因avr A進行了序列類型的分析，為我國煙草青枯病的防控工作及煙草的抗病育種提供一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 供試菌株

煙草青枯菌株由本實驗室采集分離。供試62個煙草青枯菌株和15個參考菌株見表1。

表1 供試煙草青枯菌株和參考菌株1）

續(xù)表1

1．2 供試菌株egl基因的擴增

用 于 擴 增egl 的 引 物 為：Endo－F （5′－ATGCATGCCGCTGGTCGCCGC－3′） 和 Endo－R （5′－GCGTTGCCCGGCACGAACACC－3′）［19］。 所 用 引物由上海生工生物公司合成。

PCR反應(yīng)體系組分（25μL）包含1．5 mmol／L MgCl2，250μmol／L d NTPs，50 mmol／L KCl，10 mmol／L Tris－HCl及1．25 U Taq DNA聚合酶，引物各4 p mol，50 ng模板DNA。

PCR反應(yīng)程序：96℃預(yù)變性9 min；95℃變性1 min，64℃復(fù)性1 min，72℃延伸2 min，30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存［19］。PCR擴增產(chǎn)物回收后交由上海生工公司測序。

1．3 avr A基因的擴增

用于擴增avr A的引物寡核苷酸序列為：avr AA1（5′－TGTAAAACGACGGCCAGTATGAGAAGAATYG GMAA－3′）和 avr AB1（5′－CAGGAAACAGCTATGACCTCGCTRTCGCTATCGYT－3′）［20］。

PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性1 min，58℃復(fù)性1．5 min，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存［20］。

1．4 數(shù)據(jù)分析方法

測序結(jié)果經(jīng)Bio Edit［21］軟件編輯后應(yīng)用Clustal W 軟件［22］對egl序列比對，用 MEGA4．1軟件［23］進行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用模型鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［24］，自舉分析為1 000次重復(fù)抽樣檢驗得到的自舉置信度。從Gen Bank選取12個已確定序列變種歸屬的參考菌株egl序列作為參考，以確定參試菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹中的位置；同時選取各序列變種代表性菌株及5個已確定avr A序列的參考菌株進行avr A基因氨基酸序列比對。

2 結(jié)果與分析

2．1 egl基因系統(tǒng)發(fā)育學的分析結(jié)果

參試煙草青枯病菌株的egl基因序列分布于亞洲分支以下的4個亞組內(nèi)（圖1）。采用已知序列變種的標準菌株序列作為參照，4個亞組分別被鑒定為序列變種15、17、34和44。在該4個序列變種中，序列變種15所包含的菌株數(shù)在全部供試菌株中所占比例最高，為38．7%。序列變種17略次之，為37．1%。序列變種34再次之，占19．4%。序列變種44最低，僅占4．9%。

圖1 基于egl基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

序列變種15的標準菌株為我國臺灣的番茄青枯病菌株P(guān)SS358，該序列變種包括了24個來源于福建和廣西的分離菌株，寄主品種分別為‘K326’、‘翠碧1號’、‘云煙85’以及‘云煙87’；以來源于廣西花生青枯病菌株P(guān)11作為標準菌株的序列變種17，包括23個分離自福建、廣西和貴州的菌株，分離寄主品種分別為‘K326’、‘翠碧1號’和‘紅花大金元’。其中分離自貴州的煙草青枯病菌株全部集中于該序列變種內(nèi)。

序列變種34的標準菌株為我國臺灣番茄青枯病菌株P(guān)SS219，該序列變種包括的參試菌株數(shù)目較少，且12個菌株全部分離自福建，分離品種為‘翠碧1號’和‘云煙87’；序列變種44僅包括3個分離菌株，其標準菌株為廣東油橄欖青枯病菌株O3。

2．2 avr A基因氨基酸序列比對結(jié)果

對各序列變種代表性菌株Tb2K91（序列變種34）、Tb2 K94（序列變種15）、Tb2 K99（序列變種44）和Tb2K918（序列變種17）及5個已確定avr A序列的參考菌株GMI1000、IPO1609、UW551、MOLK2和RS1000進行了氨基酸比對，結(jié)果表明4個序列變種代表菌株與亞洲菌株RS1000的序列一致，且4個序列變種代表菌株的avr A氨基酸序列并不存在差異（圖2）。

圖2 基于avr A基因的氨基酸序列比對

3 討論

青枯菌寄主范圍極為廣泛，可侵染54個科的450余種植物［25］；不同地理起源的青枯菌在與其寄主長期協(xié)同進化的過程中，演化出明顯的生理分化或菌系多樣性。以致美國科學家Buddenhagen在文章中如是寫道：“有如此之多的青枯病，和如此之多的青枯菌”［26］。

Xu等基于演化型分類框架，對國內(nèi)13個省份、17種不同寄主植物上的286個青枯菌株材料的研究結(jié)果表明：中國青枯菌種內(nèi)具有豐富的遺傳多樣性，存在亞洲分支的10個序列變種及1個美洲分支的序列變種［27］。在此基礎(chǔ)上，本研究采用該框架對福建、貴州等地區(qū)62個煙草青枯病菌株進行了系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明：62個參試煙草青枯病菌株全部歸屬于亞洲分支的4個已知序列變種，即序列變種15、17、34和44；未發(fā)現(xiàn)歸屬于美洲或非洲分支的煙草青枯病菌株（即傳統(tǒng)上的R1／Bv1菌株）。其中序列變種15和17為優(yōu)勢菌系，占全部參試菌株數(shù)的75．8%。值得注意的是，作為新鑒定出的序列變種，以我國臺灣番茄青枯病菌株P(guān)SS219為標準菌株的序列變種34雖包含的參試菌株數(shù)目較少，但無一例外均系分離自福建省的菌株；同時，分離于貴州的菌株全部歸屬于序列變種17。但由于本研究采集的菌株數(shù)目有限，這種序列變種與國內(nèi)省份或地區(qū)之間的對應(yīng)關(guān)系尚需進一步研究驗證。

某些狹窄寄主范圍的菌株歸屬于特定的序列變種。如來源于香蕉的2號小種菌株屬于序列變種3、4、6、24；來源于馬鈴薯的3號小種菌株屬于序列變種1、2，來源于姜的4號小種菌株屬于序列變種16，來源于桑的5號小種的菌株屬于序列變種12、44、48。煙草青枯菌雖屬于廣泛寄主的生理小種1，但其在致病性上具有一定的特殊性。如1975年，煙草青枯病成為美國南、北卡羅來納州煙草生產(chǎn)上最主要的病害；但毗鄰的佐治亞和佛羅里達州卻鮮有該病發(fā)生危害的報道，盡管在這些地區(qū)番茄青枯病極為普遍［20］。何禮遠對中國青枯菌致病性測定的研究結(jié)果表明：絕大多數(shù)非煙草寄主的青枯菌株不能對煙草致??；但煙草菌株Tb2不僅對煙草致病，還對茄科、花生和辣椒等其他寄主植物具不同程度的致病能力［28］。本研究表明福建、貴州等地區(qū)煙草青枯菌存在于序列變種15、17、34和44，但是否僅存于這4個序列變種尚需今后更多的煙草菌株來驗證。

本研究進一步對采集的煙草青枯病菌4個序列變種的代表性菌株進行了氨基酸比對分析。結(jié)果表明，4個序列變種代表菌株的avr A氨基酸序列并不存在差異，都屬于日本菌株RS1000類型而非GMI1000類型。但因為這兩種類型的無毒基因avr A讀碼框是一致的，所以無毒基因avr A類型與青枯菌株對煙草致病力之間是否存在相關(guān)性尚需明確。

作為青枯病防控策略的首選措施之一，抗病育種一直以來備受各國研究者的青睞。但由于青枯菌群體所特有的高度適應(yīng)性及變異性，又成為長期困擾抗病育種研究人員的難題。故而，成功培育抗性品種的先決條件是揭示出青枯菌這一復(fù)雜群體內(nèi)部豐富的遺傳多樣性［29］。國際上以美國為代表的煙草抗青枯病育種工作，主要是針對演化型Ⅱ型（美洲分支）煙草青枯病菌株開展的。本研究的結(jié)果揭示出國內(nèi)對煙草致病的菌株均系演化型Ⅰ型菌株（亞洲分支），因此亟需評價國內(nèi)煙草青枯病菌4個序列變種對現(xiàn)有煙草抗病品種的毒性水平差異，藉以指導現(xiàn)有品種的合理布局；同時，根據(jù)我國煙草青枯菌的遺傳背景選育新的抗病品種。

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