倪靜怡,楊 磊,朱興華,茅國新

(南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院,1.腫瘤內(nèi)科;2.病理科,江蘇南通,226361; 3.南通大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科,江蘇南通,226001)

統(tǒng)計分析表明[1],ⅠA～ⅢA期能完全切除的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者5年生存率為23%～67%,晚期NSCLC的5年生存率不超過15%。雖然近年來靶向治療使NSCLC的有效率有所提高,但總的5年生存率改變很小。導(dǎo)致肺癌患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)、耐藥及轉(zhuǎn)移等現(xiàn)象的根源是腫瘤組織中的小部分腫瘤干細(xì)胞(CSCs)。CSCs具備無限增殖、自我更新和多向分化潛能,是形成腫瘤和促使腫瘤不斷生長的根源,具有抗損傷、耐藥及轉(zhuǎn)移能力,針對CSCs的治療將是治療惡性腫瘤新的突破點。確定特異性的CSCs標(biāo)記物,對CSCs的分選及靶向腫瘤干細(xì)胞藥物的開發(fā)都有重要意義,但是目前尚未發(fā)現(xiàn)分離鑒定CSCs的統(tǒng)一分子標(biāo)記。既往研究[2-5]發(fā)現(xiàn),在多種實體瘤CSCs中均有CD133表達,并經(jīng)體內(nèi)外試驗證實了CD133+細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞特征。還有研究[6]發(fā)現(xiàn),胚胎干細(xì)胞的特異性基因 OCT4在NSCLC中表達,并與CD133+肺癌細(xì)胞有一定聯(lián)系。本研究采用免疫組化的方法,檢測NSCLC組織、癌旁組織及正常肺組織中OCT4及CD133的表達水平,并探討OCT4、CD133表達與臨床病理特征之間的關(guān)系,現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2007年5月—2009年5月間在本院經(jīng)手術(shù)切除或活檢、病理證實的NSCLC患者50例,均有術(shù)后隨訪資料。其中男27例,女23例,年齡35～70歲,中位年齡53歲;肺鱗癌29例,腺癌18例,大細(xì)胞癌3例;高分化15例,中分化29例,低分化及未分化6例;有遠處轉(zhuǎn)移者15例。同時選取20例癌旁組織和20例正常肺組織作為對照。

1.2 試劑與儀器

羊抗人CD133多克隆抗體、鼠抗人OCT4單克隆抗體、ELIVISON試劑盒(PV900)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)酶底物顯色試劑盒,均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

所有標(biāo)本都經(jīng)過10%甲醛固定、常規(guī)石蠟包埋,并制成4μm的連續(xù)切片,行免疫組化染色,將切片脫蠟至水化,高溫高壓修復(fù);將抗體稀釋至1∶100,取已知陽性組織作陽性對照,磷酸鹽緩沖液(PBS)替代一抗作陰性對照。DAB顯色,用蘇木精復(fù)染、脫水、透明,最后封片。采用免疫組化法分析NSCLC組織與癌旁組織、正常肺組織中OCT4和CD133表達情況,分析OCT4和CD133表達與患者的臨床特征之間的關(guān)系以及NSCLC癌組織中OCT4、CD133的相關(guān)性。

1.4 判斷標(biāo)準(zhǔn)

免疫組化結(jié)果觀察由2名資深病理科醫(yī)師共同閱片。按著色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)計分,<20%為0分,≥20%且<50%為1分,≥50%為2分;按著色強度計分,無著色為0分,淡黃色顆粒為1分,棕黃色顆粒為2分。將色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)計分與著色強度計分相乘,總計分0分為陰性(-),1～2分為弱陽性(+),4分為強陽性(6)。

2 結(jié) 果

2.1 3組OCT4、CD133蛋白的表達

50例NSCLC癌組織、癌旁組織及正常肺組織OCT4蛋白表達率分別為42.00%(21/50)、10.00%(2/20)和15.00%(3/20),而CD133蛋白表達率分別為61.00%(32/50)、10.00%(2/20)和20.00%(4/20),癌旁組織及正常肺組織OCT4、CD133蛋白的表達率均顯著低于NSCLC癌組織(P<0.05)。OCT4陽性顆粒主要定位在細(xì)胞核,CD133陽性顆粒主要定位在細(xì)胞膜,均呈散在或小簇分布,見圖1。

圖1 NSCLC腫瘤組織免疫組化染色示例圖 (20倍) A.OCT4免疫組化染色 (1例腺癌患者); B.OCT4免疫組化染色 (1例鱗癌患者); C.CD133免疫組化染色 (1例腺癌患者); D.CD133免疫組化染色 (1例鱗癌患者)

2.2 OCT4、CD133蛋白與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系

OCT4在低分化及未分化癌組織中的表達率高于高、中分化組織(P<0.05),OCT4及CD133在有遠處轉(zhuǎn)移的NSCLC癌組織中的表達率高于無遠處轉(zhuǎn)移(P<0.05),提示OCT4在NSCLC癌組織中的表達率與其分化程度以及有無遠處轉(zhuǎn)移有關(guān),CD133在NSCLC癌組織中的表達率與有無遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)。見表1。

表1 OCT4、CD133蛋白表達與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 OCT4與CD133的相關(guān)性

50例NSCLC癌組織中,OCT4與CD133共同陽性15例,共同陰性12例,見表2。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析,2者之間有明顯相關(guān)性(P=0.0218)。

表2 OCT4與CD133蛋白的共表達關(guān)系(例)

3 討 論

干細(xì)胞是一種未分化的原始細(xì)胞,在特定的條件下,它可以分化成不同的功能細(xì)胞,形成多種組織和器官[7]。1997年,Bonnet等從髓系白血病患者骨髓中分離鑒定出第1個CSCs:白血病干細(xì)胞,其表型為 CD34+CD38-。Collins等[3]從前列腺癌組織中分離出了前列腺癌干細(xì)胞,其表型為 CD44+/α2β1hi/CD133+,這些前列腺癌干細(xì)胞在前列腺癌組織所占的比例約為0.1%。接著O′Brien等[4]在結(jié)腸癌的組織中分離出了人結(jié)腸癌干細(xì)胞,它也表達CD133+,同時還發(fā)現(xiàn)這群細(xì)胞具有自我更新和分化重建的能力。

在白血病、前列腺癌和結(jié)腸癌等腫瘤中相繼發(fā)現(xiàn)了CSCs之后,人們將目光聚集到肺癌上,尤其是NSCLC。2005年,Kim等[8]采用流式細(xì)胞術(shù)分選從支氣管和肺泡導(dǎo)管交界處分離出一群細(xì)胞,其表面標(biāo)志為Sca-1+CD45-Pecam-CD34+,即支氣管肺泡干細(xì)胞(BASCs)。在正常情況下BASCs處于休眠狀態(tài),當(dāng)支氣管和肺泡發(fā)生損傷時,BASCs開始增殖,此時BASCs顯現(xiàn)出自我更新特性,并且能夠分化成其它類型的上皮細(xì)胞。另外,BASCs具有自我更新、克隆性增殖及多向分化潛能,可見BASCs具備干細(xì)胞特性。Eramo等[9]在體外實驗中發(fā)現(xiàn),在NSCLC組織中存在著一群表達CD133+的未分化細(xì)胞,它能在無血清培養(yǎng)基中不斷增殖;同時Eramo還在重度免疫缺陷小鼠體內(nèi)接種了1×104個CD133+的肺癌細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)出現(xiàn)了與原發(fā)瘤相同表型的腫瘤,可見,此類細(xì)胞有著干細(xì)胞特性。Pircher等[10]經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn),NSCLC中的內(nèi)皮祖細(xì)胞也表達CD133,因此他們認(rèn)為NSCLC中的內(nèi)皮祖細(xì)胞可能來源于肺癌干細(xì)胞。

人的OCT4基因位于6號染色體上(6p21.31),長度為16.40 kb,具有多個轉(zhuǎn)錄起始位點,轉(zhuǎn)錄不同的mRNA亞型,從而翻譯成多種蛋白質(zhì)。Sotomayor等[11]發(fā)現(xiàn)在前列腺癌中有一種被認(rèn)為是干細(xì)胞來源的細(xì)胞,即神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞,OCT4可標(biāo)記此種細(xì)胞。CD133基因位于4號染色體, CD133蛋白為細(xì)胞膜蛋白超家族成員。Huang等[12]經(jīng)過臨床研究發(fā)現(xiàn)CD133+腫瘤細(xì)胞雖數(shù)量極少,但對腫瘤的增殖、分化、浸潤以及復(fù)發(fā)有著重要的意義。

本研究中,在正常肺組織及癌旁組織中OCT4和CD133均呈低表達,而在NSCLC組織中陽性率分別為42.00%和61.00%;OCT4高表達與肺癌的分化程度、有無遠處轉(zhuǎn)移相關(guān),與性別、年齡、病理類型等無關(guān);OCT4表達隨分化程度的降低而增高,有遠處轉(zhuǎn)移的組織顯著高于無遠處轉(zhuǎn)移;CD133高表達與人類肺癌的有無遠處轉(zhuǎn)移相關(guān);OCT4與CD133之間存在明顯相關(guān)性?？傊?OCT4和CD133在肺癌中高表達,與肺癌的分化、進展、轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系,可作為一種有價值的分子標(biāo)志物,為肺癌的早期預(yù)防和早期診斷服務(wù)。此外,OCT4分子與CD133分子在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展、分化及遠處轉(zhuǎn)移上或許存在某些相關(guān)性或協(xié)同作用,有待進一步研究。

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